應用酵素結合免疫吸附測同法，檢測肉豬血清、尿液
及飼料中磺胺二甲嘧啶殘留量操作技術
一、測試原理
磺胺二甲嘧啶直接式酵素結合免疫吸附測定法(SMT One-Step ELISA)係依據固相免疫分析技術(solid phase immunoassay technology)，以微量測試孔(Microtiter well)當做固相物之檢測試驗，即於微量測試孔內塗附有對SMT具高度親和性之單源抗體(monoclonal antibody)，此抗體僅能和SMT產生結合反應。每一微量測試孔條(Microtiter well strips)係由12個測試孔組成，操作時第一孔為陰性對照液，第二孔為已知SMT濃度之陽性對照液，其餘各孔為待測樣品檢液。當各孔中都加入SMT酵素結合體後，它就會與陽性對照液及待測樣品檢液競爭孔內陽性對照液間之顏色比較來測知該樣品SMT之含量。顏色愈深表示含藥量愈少，反之則愈高。反應結果以肉眼比色做初步判定或以酵素免疫分析閱讀儀(EIA reader)做正確判定和半定量。
二、測試器材
(一)高速酵素免疫分析閱讀儀(Enzyme Immunoassay Reader, EIA Reader)儀器規格性能詳如下列：
體 重：8.0"×10.0"×2.3" (200×250×60mm)
重 量：71bs (3.2Kg)
輸入方式：雙色高等速
輸入容量：12架、96管
每次掃描最多可讀20管
資料控制：光學感應條碼
輸 出：20行熱感式印表機RS232C，1200band
精 密 度：同次掃描誤差度1％
每次掃描誤差度2％
波 長：雙重固定干擾濾光鏡，650mm & 450mm
電 壓：100-220VAC
品 名：ULTRASCAN CLINICAL ANALYZER
型 號：UI-001
製造商：SPECIALTY MEDICAL INDUSTRIES INC. U. S. A.
儀器操作說明詳見附錄(一)
(二)磺胺二甲嘧啶酵素免疫微量測試孔試劑套組(SMT Microtiter well test kit)〔註1〕
此套組包括：
1.微量測試孔(Microtiter well)，8 strips／盒，12wells／strip；塗附磺胺二甲嘧啶抗體。
2.磺胺二甲嘧啶酵素結合體(SMT-Enzyme)1瓶，容量12ml。
3.受鋛質A (Substrate A)1瓶，容量10ml。
4.受鋛質B (Substrate B)1瓶，容量10ml。
5.清洗液2瓶，容量125ml／瓶。
6.稀釋液4瓶，容量125ml／瓶。
製造商：INTERNATIONAL DIAGNOSTIC SYSTEMS CORP
(三)其它必備器材：
離心機、均質機、均質瓶、定量分注器、微量自動吸管(12孔及單孔)、吸管尖頭、洗滌瓶、定量瓶、注射筒、採血針、燒杯、吸管、濾紙、漏斗、試管、試管架、甲醇、磺胺二甲嘧啶標準品及豬隻保定器等。
三、標準液之配製
(一)精確秤取25mg磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine, SMT)標準品置於定量瓶中，以甲醇溶解並定量至25ml，其濃度為1,000μg／ml當作原液。
(二)吸取原液0.1ml置於定量瓶中，以磺胺二甲嘧啶酵素免疫微量測試孔試劑套組(SMT Microtiter well test kit)中之Dilution Butter稀釋定量至100ml，其濃度為1μg／ml當做標準液。
(三)取標準液0.1ml置於定量瓶中，再以Dilution Buffer定量至100ml，其濃度為0.001μg／ml當作空白檢液取得試驗之陽性對照液。
四、檢液之製備
(一)血 清：
頸靜脤採血約5ml注入試管中靜置，俟凝固後再離心分離(2,000 rpm，10分鐘)，取上清液0.2ml置於試管中加入1.8ml Dilution Buffer，振盪混合後即為10倍稀釋之檢液。
(二)尿 液：
收集尿液約5ml置於試管中離心分離，取上清液0.1ml置於試管中加入2.9ml Dilution Buffer，振盪混合物即為30倍稀釋之檢液。
(三)飼 料：
秤取50g飼料置於均質瓶中，加入80％甲醇溶液100ml後均質3分鐘，以濾紙(Whatman NO. 4)過濾，取濾液0.1ml置於試管中加入4.9ml Dilution Buffer，振盪混合後即為100倍稀釋之檢液。
五、空白檢液之取得
方法Ⅰ：依照本法所述之檢液製備與測試步驟，共以高速酵素免疫分析閱讀儀檢測其吸光值，選取高於陽性對照液吸光值的樣品液當作空白檢液。
方法Ⅱ：採用化學方法進行樣品萃取後，再以TLC法做定性分析確認無SMT殘留者，該樣品檢液可當做空白檢液。
六、陽性對照檢液之配製〔註2〕
(一)血清試驗：
取經10倍稀釋之空白血清檢液4.9ml置於試管中，再加入0.1ml SMT標準液(濃度1μg／ml)，振盪混合後即為陽性對照檢液，其SMT含量為0.02μg／ml。
(二)尿液試驗：
取經30倍稀釋之空白尿液檢液4.9ml置於試管中，再加入0.1ml SMT標準液(濃度1μg／ml)，振盪混合後即為陽性對照檢液，其SMT含量為0.02μg／ml。
(三)飼料試驗：
取經100倍稀釋之空白飼料檢液9.8ml置於試管中，再加入0.2ml SMT標準液(濃度1μg／ml)，振盪混合後即為陽性對照檢液，其SMT含量為0.02μg／ml。
七、測試步驟〔註3－5〕
(一)將微量測試孔條嵌入固定盤架並置於檯面白紙上，以附提把之測試孔為起點，依序將對照檢液及待測樣品檢液號碼註明於該紙上。
(二)於第一孔內注入空白樣品(血清、尿液或飼料)檢液20ul，當作陰性對照液。
(三)於第二孔內注入陽性對照檢液20ul。
(四)於其餘各孔內分別注入待測樣品檢液20ul。
(五)每孔內均加入磺胺二甲嘧啶酵素結合體100ul，輕輕振盪混合。
(六)於室溫下反應20分鐘。
(七)以清洗液沖洗各孔至少3次，倒棄清洗液並敲乾。
(八)每孔內均加入受鋛質混合液150ul。
(九)於室溫下反應10分鐘。
(十)使用高速酵素免疫分析閱讀儀以波長650nm掃描判讀。
八、結果判定
(一)若樣品檢液之吸光值大於陽性對照檢液時，則表示該樣品中SMT之含量小於陽性對照檢液中SMT之濃度。〔註6〕
(二)反之若樣品檢液之吸光值小於或等於陽性對照檢液時，則表示該樣品中SMT之含量大於或等於陽性對照檢液中SMT之濃度。
(三)依據豬血清、尿液與肌肉中SMT殘留量關係係數〔註7〕加以推算，當血清中SMT含量為0.2ug／ml；尿液中為0.6ug／ml時，則肌肉中SMT殘留量為0.05PPM。若以此值為篩選判定基準則前述樣品吸光值大於陽性對照檢液時判為陰性或合格，反之小於或等於陽性對照檢液時判為陽性或不合格。〔註8－9〕
註 解
1.微量測試孔試劑套組應於冰箱冷藏(4∼8℃)保存，禁忌凍結，有效使用期限為六個月。
2.陽性對照檢液不宜長久保存重複使用，應於每次試驗前重新配製以免影響判定結果。
3.測定孔及試劑應於每次試驗操作前自冰箱取出並放置室溫約1小時使各試劑均達室溫(23∼29℃)，注意勿讓試劑過熱(超過35℃)，微量測試孔條取出量亦應視測試樣品量之多寡而定，不需全部取出且測試孔條只能使用一次。試劑中均添加有抗生物質當作防腐劑，具危險性，應避免接觸皮膚，若不慎觸及亦應立即以清水沖洗。
4.受鋛質混合液應視實際需要量，於每次試驗前以受鋛質A液及B液等量混合後隨即使用，配製時應注意使用不同吸管尖頭以避免交叉污染，新配製混合液正常為無色透明，但久置後會變藍色故不宜保存使用。
5.進行空白樣品檢液之取得試驗時，除測試步驟2改以Dilution Buffer當做陰性對照，步驟3.改以SMT標準液(濃度為0.001μg／ml)當做陽性對照液外，其餘步驟不變。
6.陽性對照檢液中SMT之濃度，血清、尿液和飼料均為0.02μg／ml，經分別乘以稀釋倍數，則實際含量血清為0.2μg／ml，尿液為0.6μg／ml，飼料為2μg／g。
7.根據美國農業部食品安全檢驗署(FSIS，USDA) VICTOR W. RANDECKER等五名專家發表於JOURNAL OF FOOD PROTECTION, 1987，50，P.115∼122試驗報告有關豬隻血清、尿液與肌肉中SMT殘留量關係之結論如下：
肌肉中SMT殘留量(ppm)＝血清中SMT殘留濃度×0.24
肌肉中SMT殘留量(ppm)＝血清中SMT殘留濃度×0.08
換言之即血清濃度為肌肉之4.2倍，尿液濃度為肌肉之12.5倍。
8.若肌肉中SMT殘留量以0.1ppm為篩選判定基準則血清試驗中陽性對照檢液SMT之實際含量應為0.4μg／ml，尿液試驗中陽性對照檢液SMT之實際含量應為1.2μg／ml。
9.每次檢測操作必需同時要有陰性和陽性對照各一，並應使用不同之吸管尖頭吸取檢液，以免因彼此相互污染而影響判定結果，為確認本試驗結果之正確性，陰性對照(第一孔)應呈顯著藍色反應。
飼料中磺胺二甲嘧啶酵素結合免疫吸附測定法(SMT ELISA)操作流程：
(1)樣品萃取
飼料(10g)
80％甲醇溶液20ml
振盪器水平振盪10分鐘
離心分離(2000rpm，5分鐘)
上清液
(2)檢液配製
取上清液0.1ml加入4.9ml，Dilution buffer於試管中振盪混勻即成100倍稀釋樣品檢液。
(3)陽性對照液配製
(A)飼料加藥0.2ppm：秤取10g空白飼料添加200ul磺胺二甲嘧啶標準液(10μg／ml)。
(B)飼料加藥0.2ppm：秤取10g空白飼料添加200ul磺胺二甲嘧啶標準液(100μg／ml)。
加藥飼料依上述樣品萃取和檢液配製成陽性對照液(A) & (B)。
(4)測試步驟
1將微量測試孔條嵌入固定盤架上。
2.第一孔內注入陽性對照液(A) 20ul。
3.第二孔內注入陽性對照液(B) 20ul。
4.其餘各孔內分別注入待測樣品檢液20ul。
5.加入磺胺二甲嘧啶醇素結合液100ul。
6.室溫反應20分鐘。
7.使用清洗器以清洗液沖洗至少3次後吸乾。
8.加入受鋛質混合液150ul。
9.室溫反應10分鐘。
10.以波長650nm之EIA reader判讀。
(5)判 定
1.當樣品吸光值大於飼料加藥0.2ppm時，判為ND(未驗出)。
2.當樣品吸光值大於飼料加藥0.2ppm但小於加藥0.2ppm時，判為SMT＜2.0ppm。
3.當樣品吸光值小於飼料加藥2.0ppm時，判為SMT＞2.0ppm。
附 註：
1.本法設定磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine；SMT)最低檢測感度0.2ppm。
2空白飼料之檢出：
(1)採用本測法選取吸光值大於Dilution buffer之樣品當做空白飼料。
(2)採用化學方法進行樣品萃取後，再以TLC法做定性分析，確認無SMT殘留者，可當做空白飼料樣品。
附錄一 高速酵素免疫分析閱讀儀操作說明
Ⅰ、操作說明
酵素免疫測量儀是一種智慧設計之光學分光儀器，專為讀取酵素免疫試劑測量及醫療檢驗測試之測量值。它讀取所有通過儀器頂部的測光孔之試管或微量測試孔的濃度。條碼附在酵素免疫測量儀附件之微量測試孔盛放架內以控制檢測程式及數據歸納與整理。此結果很快便可列印出來。
Ⅱ、輸入原理
酵素免疫測量儀快速的讀取樣品的吸光值，光源由燈光發出後經修正為兩道光束，每道光束被濾鏡吸收後再由不同的光學感應器收集，條碼選擇檢測所需之波長作數據的歸納整理。酵素免疫測量儀擁有專利號碼US PATENT 4,729,661。光束逐次通過試管並由內設的兩部微處理器記錄結果，此種逐次測試可避免試管或微測試孔內產生誤差的影響。
樣品經由雙色吸光法測量，但準確度較差，測量狀態及波長會印在結果報告上。用雙色比較吸光測量法，第一次及第二次的檢測結果會有差異，可經由選擇校正。
Ⅲ、條 碼
條碼是操作本儀器的鑰匙，條碼可避免樣品測量時的誤差並作立即更新。條碼輸入與樣品測量同時進行，條碼可輸入下列資料：
1.檢驗名稱 6.單 位
2.數據歸納方法 7.標準值濃度
3.控制組數量 8.波 長
4.讀取模式 9.間次測量間隔時間
5.結果輸出格式
條碼是塑膠片模式供應，每一種測試有特定之條碼，均勿在操作中更換條碼。
Ⅳ、架 子
本儀器可配用不同的架子，每種可盛裝樣品及條碼。條碼以固定之方向填裝入架子的底部。試管架一次可盛裝12支試管，試管可從架子上方放入，放入試管時稍微旋以便試管之插入，架子設計為試管開口向上之插入狀態。試管插入後放於平坦桌面並向下壓以使試管齊平。某些試管有不同之半徑規格而試管架只適合一種半徑規格以避免造成不同吸光值的誤差。
微測量孔置放架可容納一條12孔的微測量孔，微測量孔以開口向上之方向置入於架子底部的較大凹槽內，插入後置放於平坦桌面並向下壓以使其齊平。某些微測量孔可以按照需求量折開使用於本儀器內測量。
Ⅴ、操作流程：
1.開啟電源，儀器印出：ULTRASCAN READY READ ASSAY NOW？
2.按下YES開始測試或按下NO選擇特殊功能。
3.置放待測樣品及條碼。
4.按下YES後儀器印出：LAMP WARMUP…………
5.10秒後印出：READY：PUSH NO TO END
6.將測試架放入測量槽並向前滑動開始測試。
7.測完後儀器發出嗶嗶聲，以相同方法測量其餘樣品。
8.所有樣品均測完後按下NO，即將結果印出備用。
本儀器次循環可測試96個樣品。每一次測完後如沒有下一步指示，則經過一分鐘後儀器自動印出：TIME EXPIRED.如果按下NO自動印出結果報告。
附錄二 食用畜肉類衛生標準
76.2.21 衛署食字第647195號公告
| 類別＼項目 | 性 狀 | 每 公 克 中生 菌 數 | 每百公克中揮發性鹽基態氮 | 磺 胺 劑殘 留 量 |
鮮 肉 |
應具有各種肉類良好風味色澤，不得有腐敗、不良變色、異臭、異味、污染或含有異物、寄生蟲或其他異狀 | 三千萬以下 | 20mg以下 | 0.1ppm以下 |
| 註：冷凍肉並應符合冷凍食品類衛生標準之規定。 | ||||
附錄三 動物用藥殘留標準
76.4.11 衛署食字第658449號公告動物用藥殘留標準
| 藥 品 名 稱 | 禽 畜 種 類 | 殘 留 部 位 | 殘留標準(ppm) |
| 氯啶(Clopidol) | 豬。 牛、綿羊、山羊。 牛、綿羊、山羊。 牛、綿羊、山羊。 雞、火雞。 雞、火雞。 乳牛、山羊。 |
可食部分 肌肉 肝 腎 肌肉 肝 乳 |
0.2 0.2 1.5 3 5 15 0.02 |
| 富來頓(Furazolidone) | 豬、雞、火雞。 | 可食部分 | 0 |
| 硝化富樂遜(Nitrofurazone) | 豬、雞、火雞。 | 可食部分 | 0 |
| 滴克奎諾(Decoquinate) | 牛、雞。 牛、雞。 |
肌肉 肝，腎 |
1 2 |
| 孟寧素(Monensin) | 牛、雞。 | 可食部分 | 0.05 |
| 卡巴得(Carbadox) | 豬。 | 可食部分 | 0.03 |
| 羅苯嘧啶(Robenidine)Hydrochloride | 雞。 雞。 |
可食皮、脂 其他可食部分 |
0.2 0.1 |
| 磺胺劑(Sulfadrugs) | 牛、小牛、豬、雞、火雞。 雞、鴨、鵪鶉。 乳牛、山羊。 |
可食部分 蛋 乳 |
0.1 0.1 0.01 |
| 配尼西林(Penicillin) | 牛、小牛。 火雞。 豬、雞、雉、鵪鶉、綿羊。 |
可食部分 可食部分 可食部分 |
0 0 0 |
| 鏈黴素(Streptomycin) | 豬、雞、火雞。 | 可食部分 | 0 |
| 四環素(Tetracycline) | 小牛、綿羊、山羊、豬、雞、火雞。 | 可食部分 | 0.25 |
| 泰黴素(Tylosin) | 牛、小牛、豬、雞、火雞。 雞、鴨。 乳牛。 |
可食部分 蛋 乳 |
0.2 0.2 0.05 |
| 紅黴素(Erythromycin) | 豬。 雞、火雞。 雞。 牛。 乳牛、山羊。 |
可食部分 可食部分 蛋 可食部分 乳 |
0.1 0.125 0.025 0 0 |
| 新黴素(Neomycin) | 小牛。 乳牛、山羊。 |
可食部分 乳 |
0.25 0.15 |
| 健牠徽素(Gentamicin sulfate) | 火雞。 豬。 豬。 豬。 |
可食部分 肌肉 肝 脂、腎 |
0.1 0.1 0.3 0.4 |
| 林可黴素(Lincomycin) | 豬、雞。 乳牛、山羊。 |
可食部分 乳 |
0.1 0.15 |
| 羥四環素(Oxytetracycline) | 牛、豬。 雞、火雞。 雞、火雞。 |
可食部分 可食部分 腎 |
0.1 1 3 |
| 氯四環素(Chlortetracycline) | 牛、未泌乳之乳牛。 牛、未泌乳之乳牛。 小牛、豬。 豬。 豬。 小牛。 豬。 小牛 。 乳牛、山羊。 綿羊。 綿羊。 綿羊。 雞、火雞、鴨。 雞、火雞、鴨。 |
肌肉、肝、腎 脂 肌肉 肝 腎 脂 脂 肝、腎 乳 肌肉 腎 肝 可食部分 蛋 |
0.1 0 1 2 4 1 0.2 4 0 0.1 1 0.05 1 0 |
| 已烯雌酚 (Diethylstilbestrol) |
牛、綿羊、山羊、雞 | 肌肉、肝 | 0 |
| 註：本表未列者，不得檢出。 | |||
附錄四 肉品中殘留藥物限量標準
76.9.8衛署食字第683805號
| 殘 留 藥 物 | 限 量(ppm) | 備 註 |
| 滴 滴 涕 (DDT) | 5 | 1.本標準未列者，不得檢出。 2.殘留藥物均包括其衍生物。 3.脂肪基準。 |
| 地特靈及阿特靈 (Dieldrin & Aldrin) | 0.2 | |
| 飛 佈 達 (Heptachlor) | 0.2 |
資料來源：台灣養豬科學研究所
飼料營養雜誌(19~32)－鄭幸祥．九一年四期
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