單葉豆癒合組織的誘導與分化

摘   要

        本試驗的目的在培養單葉豆之幼葉、幼莖與生長點,以瞭解誘導癒合組織形成及分化的適當培養基。將培植體培養在MS基本鹽類、維生素2,4-D (1∼6mg/l)等四種培養基中,均能誘導Callus的形成;僅幼葉與生長點所誘導的Callus,在含Kinetin (2mg/l)與BA (1mg/l)的培養基中,才有分化的植株形成,其中又以D4 (2,4-d4mg/l)與D6 (2,4-D 6mg/l)所誘導的Callus較具分化的能力;以幼葉為培植體者,由D4移至K1 (Kinetin 1mg/l),其分化成植株的比率為20.0%,由D4移至K2 (Kinetin 2mg/l)為26.7%;由D6移至K1者為35.9%,由D6移至K2者為59.5%。以生長點為培植體者,由D4移至K1者,其分化成植株的比率為22.2%,D4移至K2者為30.0%;另D6移至K1者為40.7%,D6移至K2者為51.8%。

緒   言

        本省在豆科牧草的栽培及育種研究甚少,而一些地域性的豆科牧草,具有很大的發展潛力,如單葉豆在本省南部,特別是恆春半島,生長良好且具備一些優良性狀,如植株高大、葉莖比例高與適合放牧等的品系,可以提供牛羊高品質的芻料。

        在園藝、農藝及牧草作物,利用組織培養技術於品種改良以及快速與大量繁殖無病毒之健康幼苗,已有相當的成果,尤其是不能以種子繁殖者,如多年生牧草與果樹等。以禾科本牧草而言,如盤固草(Cheng, 1987;Cheng and Lo, 1987)、狼尾草(Wang and Vasil, 1982)、藍莖草(Songstad et al; 1986)與黑麥草(Ahloowalia, 1975)等,在這方面的研究,已有一些成果,而在豆科牧草方面,如苜蓿利用組織培養技術來達到品種改良,更獲致相當的成果,但是在單葉豆方面,則尚無研究。

        在苜蓿的組織培養研究,利用原生質體培養,並成功地分化出正常植株(Atanassov and Brown, 1984;Diuak and Brown, 1987;Johnson et al; 1981;Johnson et al., 1984);另利用葉肉細胞分離出原生質體(Lu and Cocking, 1982;Xu et al.,1982),培養後亦能分化成植株的有白三葉草與驢食豆等;其它的豆科植物,如綠豆(Xu et al., 1981)與大豆(Xu et al., 1982),能由根的細胞分離出原生質體,並形成根的分化(Xu et al., 1982)。至於單葉豆屬植物,則尚無這方面的研究;本試驗的目的是針對單葉豆之幼嫩的葉、莖及生長點為培植體,以尋求適當的培養基,並觀察其癒傷組織的形成與分化,作為提供進一步培養或育種改良的基礎。

材料與方法

        一、於77年9月以單葉豆(Alysicarpus nummularifolius)之幼嫩植株(株高在10∼20公分)的幼葉、幼莖及生長點,以1% Naocl消毒3分鐘,再用無菌水沖洗三次,而後將此三種培植體在無菌操作台中,切成約0.3公分長之小片塊,然後再移植在無菌的固體培養基中,培養基為含不同濃度2,4-D及其它有機成分如inositol與Thiamine,移植物的培植體,置於25℃,無光照的培養架上,作癒合組織的誘導。

        二、所誘導的癒合組織再移至分化的培養基(K1與K2)中,並置25℃,400Lux光照下的培養架上,誘導癒合組織的分化。

        三、培養基成分:為MS基本鹽類(10),Inositol (100mg/l)與糖(30g/l),另加不同濃度的2,4-D,組成四種培養基,其2,4-D的濃度分別為D1 (1mg/l),D2 (2mg/l),D4 (4mg/l)與D6 (6mg/l),培養基之pH為5.8,最後加Agar (8g/l)而形成誘導癒合組織的固體培養基。

        誘導癒合組織分化的培養基之成分為:MS基本鹽類,Inositol (100mg/l),Thiamine (1g/l),另加BA (1mg/l)與Kinetin (1與2mg/l)組成二種分化的培養基K1(Kinetin 1mg/l)與K2 (Kinetin 2mg/l)。

結果與討論

一、不同培養基與不同培植體對單葉豆癒合組織形成的影響

        將單葉豆的幼葉、幼莖及生長點(植株高度在10∼20cm)培養在不同濃度之2,4-D之培養基上,癒合組織形成的時間在培植體培養後第八天,不同培養基所誘導的癒合組織,其所需的時間並無明顯的差異,20天後癒合組織形成的百分比,結果如表(一):不同的培植體在不同的培養基中,其癒合組織形成的比率幾近100%,且其間沒有差異,由此結果得知:在不同2,4-D濃度下(1,2,4及6mg/l)均能誘導單葉豆幼葉、幼莖與生長點癒合組織的形成。唯一不同的是,在較高濃度2,4-D (4與6 mg/l)下,所誘導形成的癒合組織,其結構較為緻密,而低濃度2,4-D (1與2mg/l)下,所誘導形成的癒合組織,其結構則較為鬆軟,據Shei (1983)報告指出,癒合組織是否具有分化的能力,與其癒合組織是否具有分化的能力,與其癒合組織本身的結構有關,就紅燕麥而言,癒合組織結構緊密者,其分化的能力較強。

表(一) 不同培養基對單葉豆不同部份之誘導其癒合組織的形成
培養基Media 幼葉 Young leaf 幼莖 Young stem 生長點 Meristem
─────────── % ──────────
D1

D2

D4

D6

100 (84/84)

100 (84/84)

100 (90/90)

100 (81/81)

  96 (72/75)

100 (84/84)

100 (75/75)

100 (84/84)

100 (48/48)

100 (60/60)

100 (57/57)

100 (54/54)

二、生長素對於不同培植體之癒合組織分化的影響

(1)生物素對於單葉豆由幼葉誘導形成 之癒合組織分化的影響

        將由單葉豆幼葉誘導形成的癒合組織,移植至含不同濃度Kinetin的培養基中,並置25℃,400Lux光照的培養架上10至14天,癒合組織開始有綠化的現象,Dun Well et al. (1976)報告指出:在菸草及馬鈴的組織培養中,由培植體誘導癒合組織的形成,光照並不是絕對必需的,但是癒合組織的分化,則要在有光的環境,才能正常進行,單葉豆的組織培養亦復如此。由本試驗表(二)結果所示:由幼葉誘導形成的癒合組織,移至K1與K2培養基中,並在400Lux光照下培養,結果發現由D4與D6所誘導形成的癒合組織,在K2與K2分化的培養基培養,均有分化的植株形成,但是在K2中分化成植株之百分率較在K2者少;而且D6較D4在分化培養基中,其分化成植株之百分率較高,分別是D6移至K2者,分化的比率為35.9,D6移至K2者為59.5%,而D4移至K1者僅20%,D4移至K2者26.7%。由以上的結果顯示:含低濃度2,4-D (1與2 mg/l)所誘導的癒合組織,移至含Kinetin與BA的分化培養基中,均無分化的植株形成;而含較高濃度2,4-D (4與6mg/l)所誘導的癒合組織,在K1與K2的分化培養基中,分化成植株的百分率較高,其中又以D6較D4者為高;至於兩種不同分化培養基的效果,則以K2較K1為佳。

表(二) 單葉豆苗誘導之癒合組織於不同培養基下之分化頻度
培養基Media D1 D2 D4 D6
─────────── % ───────────
K1

K2

0 (0/42)

0 (0/42)

0 (0/42)

0 (0/42)

20.0 (  9/45)

26.7 (12/45)

35.9 (14/39)

59.5 (25/42)

(2)生長素對於單葉豆由幼莖誘導形成之癒合組織分化的影響

        將單葉豆由幼莖誘導形成的癒合組織,移植至含Kinetin與BA的分化培養基中,並置於25℃,400Lux光照的培養架,結果由表3得知:由D1至D6所誘導的癒合組織力移至K1或K2分化培養基中,均無分化的植株形成,由此可知:以單葉豆幼莖作培植體,在含2,4-D的培養基中所形成的癒合組織,移至含Kinetin與BA的分化培養中,均不能誘導其分化。

表(三) 單葉豆幼莖誘導之癒合組織於不同培養基下之分化頻度
培養基Media D1 D2 D4 D6
─────────── % ───────────
K1

K2

0 (0/36)

0 (0/36)

0 (0/42)

0 (0/42)

0 (0/36)

0 (0/39)

0 (0/42)

0 (0/42)

(3)生長素對於單葉豆由生長點誘導形成的癒合組織分化的影響

        將單葉豆由生長點誘導形成的癒合組織,移至K1與K2的分化培養基中,並置於25℃,400Lux光照的培養架,結果由表4顯示:由D4與D6所誘導的癒合組織,在K1與K2的分化培養基中,均有分化的植株形成,但是在K1分化或植株的百分率,較在K2者為少,分別是由D4移至K1者,分化的比率為22.2%,由D6移至K1者為40.7%;另由D4移至K2者,分化的比率為30.0%,由D6移至K2者51.8%;可知由D6與D4形成的癒合組織,在K1與K2中,D6分化的比率比較高,分別是40.7與51.8%;而由D4移至K1與K2的分化比率較低,僅為22.2與30.0%。由以上結果顯示:含低濃度2.4-D (1與2 mg/l)所誘導形成的癒合組織,在K1與K2分化的培養基中,均不能誘導癒合組織形成分化,而含較高濃度2.4-D (4與6 mg/l)所誘導形成的癒合組織,在含Kinetin與BA的分化培養基中,則能分化成正常的植株,其中又以D6者較D4為高;至於兩種不同分化培養基的效果,則以K2較K1較佳。此項由生長點與幼葉所誘導形成的癒合組織,在含Kinetin與BA的分化培養基中,所得的結果一致。亦即D4與D6所誘導兩種培植體而形成的癒合組織,在K1與K2中,均能形成植株的分化,且D6較D4與K2較K1的分化效果佳。

表(四) 單葉豆生長點誘導之癒合組織於不同培養基下之分化頻度
培養基Media D1 D2 D4 D6
─────────── % ───────────
K1

K2

0 (0/24)

0 (0/24)

0 (0/30)

0 (0/30)

22.2 (6/27)

30.0 (9/30)

40.7 (11/27)

51.8 (14/27)

        綜合本試驗的結果顯示:以單葉豆幼葉與生長點作為培植體,培養後很快即有癒合組織形成,癒合組織亦能分化成植株,可提供為一良好的育種改良及遺傳研究之材料。

 

(參考文獻略。資料來源:轉載自畜產研究第廿三卷第一期)

飼料營養雜誌(60~64)-台灣省畜產研究所、謝文彰.九一年五期

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