培養液中添加不同動物之血清與不同濃度
之牛血清蛋白對山羊精子在體外
培養時活力之維持效果
摘要
本研究旨在比較培養液中，含不同濃度之牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)與不同動物血清(blood scrum)，對維持體外培養之山羊精子，具有良好活力之效果。
山羊之射出精液，先於20℃被靜置4小時後，再經3次洗滌與離心(600-800xg，3分鐘)，將其精漿移除，俾令精子完成獲能作用。此等經體外獲能之精子，分別被懸浮於含0.4、0.8、1.2、1.6與3.2％(w／v)等，5組不同BSA濃度之體外受精培養液中，並於39℃，含5％CO2及95％空氣與100％相對濕度之條件下，予以體外培養0~8小時。各組精子之活力，並於培養終了時，分別予以取樣評估之。試驗結果顯示，當培養液中BSA之添加量少於1.2％時，精子經體外培養6小時後，具良好活力之精子百分率，均低於50％。反之，提高溶液中BSA濃度至1.6％或3.2％，則精子甚至在體外被培養8小時後，分別仍有70％與80％係具有良好活力者，且均顯著優於BSA之添加量0.8％或以下者(P＜0.05)。顯示在山羊之體外受精培養液中，BSA之添加量應不得少於1.6％甚或3.2％。
另外於前述培養液中，額外添加20％(v／v)不同動物來源之血清，包括山羊血清(goat serum)、胎犢血清(fetal calf serum)與豬血清(porcine serum)等，比較其對體外培養之山羊精子，良好活力之維持效果。試驗結果顯示，山羊精子在含有1.6％(w／v)BSA與20％(v／v)山羊血清之培養液中，被體外培養4小時後，尚能維持85％之精子具有良好活力；反之，使用相同添加量之豬血清取代山羊血清時，則精子經2小時之體外培養後，活力急降至50％以下(P＜0.05)。尤有甚者，當培養液中之山羊血清，被以相同濃度之胎犢血清取代時，則山羊精子於2小時內全體死亡。足見，山羊精子活力之體外維持，受培養液中添加血清之源自於不同動物，影響甚鉅。(關鍵語：山羊精子、精子活力、牛血清白蛋白、血清)
緒言
在進行體外受精試驗時，最常遭遇之困難，乃在體外培養過程中，不易維持好之精子活力。新鮮射出精液，其精子必需在雌性生殖道中先停留一段時間，俟完成獲能作用(capactitation)與頭巾反應(acrosome reaction)後，始具有鑽入卵母細胞內，產生正常受精作用之能力(Austin, 1951；Chang, 1951)。因此在進行哺乳動物之體外受精試驗時，常需模仿體內之生理狀況，先於體外誘發精子產生獲能作用。新近之研究結果顯示，新鮮射出精液於室溫(20℃)下被靜置一段時間後，再應用適當溶液，進行一系列之精子洗滌與離心，俾移除其精漿成分，可使精子完成其獲能作用(Iritani et al., 1984；Cheng, 1985)。惟經前述處理後之精子，於進一步之體外培養過程中，常無法維持其良好之活力。致獲能作用雖已被完成，精子亦無法鑽過卵丘細胞群(cumulus cell mass)與透明帶(zona pellucida)，故未能順利進入卵母細胞內，俾產生其正常之受精作用(Fraser, 1981；1983；1984)。
許多因素，包括：培養溫度(Mahi and Yanagimachi, 1973)、培養液之pH值(Bavister, 1969；Miyamoto et al., 1974)與培養液之組成成分，如鈣離子之濃度(Frasher, 1982)、興奮精子產生超活力(superactivity)作用物質之添加與否(Leibfried and Bavister, 1981；1982)、血清白蛋白之添加量(Yanagimachi, 1970)及使用何種動物之血清(Cheng, 1988)等，已知可顯著影響精子之體外獲能作用、獲能精子之活力與受精力。本試驗乃針對山羊精子於體外被培養時，比較培養液中牛血清白蛋白之添加量與添加不同動物之血清，對精子活力之維持效果；冀能提供做為建立山羊體外受精系統之參考。
材料與方法
本試驗使用之山羊精液，均係應用人工假陰道所集者。山羊精子之體外獲能方法，則依照Cheng(1988)所述，並略經適當修飾。主要乃令山羊精液先於20℃下靜置4小時，再應用受精用培養液(pH＝7.8)，舉行三次洗滌與離心，俾移去精漿部份。其處理要點如后：第一次取0.5ml山羊精液，與2.5ml之受精用培養液(pH＝7.8)相混合，經使用吸管反覆予以輕柔洗滌後，以600xg離心3分鐘，然後取上層液2ml與前述培養液3ml混合，舉行第二次洗滌，並經800xg離心3分鐘，移棄上層液；下層之精子沈澱顆粒，則被懸浮於3ml之前述培養液中，舉行第3次洗滌，再以600xg離心3分鐘。精子懸浮液於第3次離心後，取用上層液2ml，經檢查精子活力並計算精子濃度，然後應用受精培養液(pH＝7.4)，調整精子濃度至每ml含有5×107個精子，俾供進行體外培養試驗。
前述受精用培養液之配製，乃於每毫升TCM199中，添加0.1mg丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、0.9mg乳酸鈣(calcium lactate)、2.5mgD─葡萄糖(D─glucose)、0.1mg抗生素(i.e. Dibekacin sulfate)與20％(v／v)山羊血清(goat serum，GS；Gibco 200-6210AG)及1.6％(w／v)牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA；Fraction V, SIGMA Ltd.)等，配製而成者。惟當比較不同BSA濃度，對維持良好精子活力之影響時，則其BSA之添加量分別為0.4、0.8、1.2、1.6與3.2％不等。另外，在比較不同種別來源之血清，對於良好精子活力之維持效果時，則以20％(v／v)之胎犢血清(fetal calf serum, FCS；Gibco 200-6140 AG)與(或)豬血清(porcine serum, PS；Gibco 200-6250 AG)，取代前述之山羊血清；所有血清在使用前均經56℃予以熱不活化(heat inactivated)處理30分鐘。在該2試驗中，業經體外獲能處理之山羊精子，係被分別懸浮於各特定培養液中，並調整精子濃度至每毫升5×107個精子。此等完成稀釋之精子懸浮液，仍分別被置於39℃、5％二氧化碳、95％空氣與95~100％相對濕度等條件下，進行體外培養0~18小時；每隔2小時並分別採取各精子樣本，置於位相差顯微鏡下，檢查並比較在培養過程中，精子活力之變化情形。
精子活力之檢查，係將混合均勻之各組精液樣品，分別以玻棒各沾取各一小滴置於載玻片上，分別經蓋上蓋玻片後，再置於檢查精子活力用之恆溫器(FHK Equipments, Japan)平台上，應用低倍(×150)位相差顯微鏡，分別觀察並詳實記錄其呈現前進式游動之精子百分數。各不同試驗組間，所有觀察值亦即百分值，均先轉角度後，再應用Student's t-test分析並比較其統計上之顯著差異性，最後再轉回百分值表示於文中。
結果與討論
圖1與圖2分別為業經體外獲能之山羊精子，在添加有不同濃度之BSA與不同動物來源血清之培養液中，被舉行體外培養時，其精子活力之變化情形。由圖1所顯示，當培養液中BSA之添加量在1.2％或以下時，精子經6小時體外培養後，其擁有良好活力之精子百分率，急遽降至50％以下；反之，應用含1.6％與3.2％BSA之培養液者，經體外培養8小時後，具有良好活力之精子百分率，則分別為70％與80％。鑒於在舉行豬卵、牛卵與綿羊卵之體外受精試驗時，卵母細胞務必與該動物之獲能精子，共同於體外至少被培養6~8小時，且在該體外培養期間中，精子必需始終保持良好之活動力，方能獲有較佳之受精結果(Cheng，1985)；精子在受精過程中，良好活力之維持，乃係使精子成功鑽入卵母細胞所不可或缺者(Fraser，1981，1983，1984，Rogers，1983)。本試驗結果充分顯示，在進行山羊卵之體外受精時，其培養液中BSA之添加量，至少應以1.6％為宜。據Yanagimachi(1969，1970)與Bavister(1975)指稱，牛之血清蛋白中，存在一種對熱安定之小分子物質，稱之為"精子活力之因子(sperm motility factor, SMF)"。因此，當培養液中添加BSA時，對多種動物包括小鼠(Miyamoto and Chang 1973；Hoppe and Whitten, 1974)、兔(Davis，1976)與倉鼠(Bavister, 1981)等之精子活力，具有良好之維持效果。此外，BSA中亦被指稱含有一種大分子物質，可誘發精子產生獲能作用；特別對小鼠、兔與倉鼠等動物之精子，BSA已知係其在體外完成獲能作用所不可或缺者(Miyamoto and Chang, 1973；Hoppe and Whitten, 1974；Davis, 1976；Bavister, 1981)。尤有甚者，BSA對於完成獲能作用能之精子，更有刺激其產生頭巾反應之作用(Meizel, 1978；Bavister, 1986)。BSA是否需與精子細胞膜有直接之接觸，方能誘發獲能作用與頭巾反應之產生，雖迄未被充分肯定，惟Dow and Bavister(1989)曾有一特殊設計，係應用透析膜將腔室分隔為二，俾使BSA與精子能被分開培養，致精子無法與BSA有直接之接觸。結果證明當倉鼠精子未與BSA直接觸時，其獲能作用與頭巾反應均無從發生；反之，當倉鼠精子與BSA係被直接接觸培養時，則能完成其獲能作用與頭巾反應。
牛血清白蛋白係如何參與精子之獲能作用及頭巾反應，其詳細機構雖迄未有明；惟精子之細胞膜與雄性生殖道之分泌物中，均曾被發現有高濃度之鋅離子與膽固醇，可穩定精子之細胞膜(Aonuma et al., 1978；Andrews and Bavister, 1989)。職是之故，精子之獲能作用，可能亦涉及鋅離子與膽固醇之移除；一旦此等具有安定細胞膜之物質被移除後，精子之漿膜(plasma membrane)將與頭巾外膜(outer acrosomemembrane)發生融合作用並形成空泡化(vesiculization)，頭巾𠕇逐得以順利被釋出(Yanagimachi, 1981)。鑒於BSA已知對膽固醇與鋅離子均極具結合力，因此推測BSA對於自精子之細胞膜移去該二物質，扮有重要之角色(Peter, 1975；Aonuma et al., 1978)。
本試驗之結果(圖2)亦顯示，培養液中添加不同動物來源之血清，對山羊精子活力之維持影響甚鉅。山羊精子在含有1.6％(W／v)BSA與20％(V／V)GS之培養液中，被體外培養4小時後，其具有良好活力之精子百分率，尚能維持85％；反之，以20％(v／v)之豬血清取代山羊血清，則精子活力於體外培養2小時內，急遽降至50％以下。尤有甚者，當應用20％(v／v)之FCS取代GS時，則山羊精子於2小時內，全體死亡。足見FCS對山羊精子極具毒性；類似之結果，亦見之於Cheng(1988)在綿羊卵所舉行之體外受精試驗中，綿羊精子一旦被懸浮於含20％(v／v)FCS之培養液後，其活動力可在5分鐘內完全喪失。此等結果無異顯示，不同動物之精子，對於不同動物來源之血清，缺乏耐受力。
綜合本試驗結果，山羊射出精子在20℃下靜置4小時，並經3次洗滌與離心後，雖可完成體外獲能作用；惟當進一步被應用以舉行體外受精時，應在其培養液中，添加至少1.6％(w／v)之BSA與20％(v／v)之GS，始能維持良好之精子活力。(參考文獻略)(轉載自中國畜牧學會會誌)
飼料營養雜誌(p.96~101)─林佳靜．九三年第九期