雞卵黃中卵磷脂的分離與純化
摘要
本航雞蛋卵黃反覆以丙酮沉澱及乙醇、石油乙醚溶解，萃得約4.30％粗卵磷脂，萃製率不因原料蛋為生鮮、冷凍，水煮或鹽漬等來源而受影響，然以正已烷萃得之卵黃油則未能分離出粗卵磷脂。粗卵磷脂進一步藉三氧化二鋁管柱(4cm×87cm)層析，以氯仿：甲醇(9：1)為溶洗液，於溶出容量325~622ml份化，集得層析份化收率約佔總份化45％、總份化收率1.99％的純化卵磷脂；經TLC鑑定得悉試樣之同質性甚高，以GC測定知其脂肪酸組成以14：0、16：0及18個碳以上脂肪酸為主，分別佔總脂肪酸的2.71、32.62及51.27％，組成分類似標準品者；試樣之紅外線光譜圖與標準品相似，其成分並由碳基(-CO-，1,715cm-1)及胺基(-NH2，1,640cm-1)的呈現而得以確認。
緒言
近年來，台灣地區雞蛋在產銷失衡情況下，價格時現低迷；此外，供製蛋糕原料蛋所餘卵黃之附加價值一向有待提高；凡此，在在顯示蛋品加工利用迫切需要開發。卵黃含脂質28~36％，是僅次於水分的成分；卵黃脂質中甘油化合物62.5％、磷脂質32.8％、固醇4.9％，並有微量醣脂質(林，1983)；磷脂質是一種天然可食用、可消化的界面活性劑，廣被應用於人造乳酪、巧克力、蛋黃醬、霜飾乃至藥品、化妝品等(Windholz, 1983)。又由於卵磷脂含多種不飽和脂肪酸，在動物體內卵磷脂與膽固醇在𠕇作用下，不飽和脂肪酸轉移到膽固醇較易溶解，而易於經血液循環轉移到肝臟，形成膽酸、膽汁而排泄(Lehninger，1982)，遂被認卵磷脂可能具有降低血液中膽固醇，而對高血壓、血管疾病、動脈硬化、血栓、心臟病等具預防功用；是以近年來被視為"天然健康食品"，而競相開發自卵黃分離卵磷脂之方法(平尾，1981；長谷川，1984；Singleton et al., 1964)。
卵磷脂(phosphatidylcholine)，是一種硬脂酸、棕櫚酸及油酸等的雙酸甘油酯化合物，藉磷酸基與膽鹼結合成酯類(Windholz, 1983)。根據分子結構及官能基荷電特性，諸多有機溶媒及管柱層析材質被嚐試用以分離及純化卵磷脂；平尾(1981)利用高溫熬煉，經過濾去除雜質並以澱粉賦形，平均每個雞蛋卵黃煉得約4.5g的磷脂；長谷川(1984)則藉有機溶媒萃得磷脂含量約70％的卵黃油；Singleton et al., (1964)利用三氧化二鋁(alumina)及矽酸(silic acid)為吸附劑(adsorbent)行管柱層析，進一步純化卵磷脂。本試驗旨在組合前人的方法，驗證其應用價值。
材料與方法
Ⅰ、材料
(1)卵黃：以畜試所畜牧場所飼來航雞之生鮮雞蛋，經卵白，黃分離後供試。
(2)化學試劑：丙酮、正已烷─林純，日本；乙醇─公賣局，台灣；石油醚、三氧化二鋁、氯仿、甲醇、二乙基醚、碘、Ninhydrin、Dragendorff、二乙基碳酸鹽、矽膠、溴化鉀合成光學晶體─Merck，德國；卵磷脂(萃自生鮮雞蛋卵黃)─Sigma，美國；金屬鈉─Riedel~De Haen AG，德國。
Ⅱ、方法
(1)雞蛋一般化學組成分析：依A.O.A.C.(1990)方法。
(2)粗卵磷脂萃製：分別以生鮮卵黃、卵黃油、冷凍卵黃、煮熟卵黃及鹹卵黃等原料，修飾Singleton et al.(1965)之方法，反覆利用丙酮沉澱，乙醇及石油醚萃取，經減壓迴旋濃縮後冷藏備用。
(3)粗卵磷脂之三氧化二鋁管柱層析(Singleton, 1965，Haftmann, 1975)：
管柱製備 4cm×87cm長，管底由─玻璃棉薄層支撐。
↓
膠泥製備 以三氧化二鋁：氯仿＝1：1(W／V)調和成泥狀。
↓
裝 填 膠泥裝填至約50cm高後以氯仿流洗。
↓
粗卵磷脂吸著溶洗定量收集 藉氯仿將試樣溶入並吸著於膠粒表面溶洗液，氯仿：甲醇＝9：1(V／V)°
(4)卵磷脂之脂肪酸測定：
1. 儀器：Hitachi Model 663~50GC(日本)；以FID為檢測器。
2. 管柱：OV-11，3m長、3mm內徑。
3. 帶動氣體：He。
4. 溫度：注入口225℃；昇溫條件，60℃保持2分鐘，繼之以4℃／min速度昇至120℃並保持1分鐘，然後以5℃／min速度昇至220℃保持300分鐘。
5. 試樣前處理：依Glass et al.(1965)之方法，將試樣之脂肪酸乙酯化後取5μl注入GC。
(5)三氧化二鋁管柱層析各份化之薄層分析(Singleton, 1965)：取溶於氯仿之試驗溶液5μl，點注於矽膠板上，分別經氯仿：甲醇：水＝325：125：20(V／V／V)及石油醚：二乙基醚＝450：50(V／V)展開各3小時，然後以1％之碘，寧海特林(Ninydrin)及突拉根道夫(Dragendorff)液染色。
(6)紅外線光譜分析：藉紅外線光譜儀(IR 260-50；Hitachi，日本)測定；取乾燥試樣0.5mg加入200mg溴化鉀，研磨後以500Kg／cm2壓力打片後行IR掃瞄。
結果與討論
Ⅰ、雞蛋之一般化學組成
表1顯示，來航雞蛋卵黃、白之固形物分別約為48及11％，與林(1983)所載無甚差異，其中卵黃之粗脂肪含量29.0％，佔全蛋脂肪之99.5％，如擬利用蛋中脂質成分，卵白幾可忽略。
表1. 雞蛋之一般化學組成分
| Samples | Moisture | Crude protein | Crude fat | Ash |
| ％ | ||||
| Yolk White |
49.81±1.16 88.38±0.87 |
16.64±0.66 10.06±0.83 |
29.06±2.20 0.12±0.02 |
1.77±0.11 0.64±0.12 |
Ⅱ、卵黃中粗卵磷脂之萃製
在卵黃約30％脂質中，62.3％為三酸甘油酯，32.8％磷脂質及4.9％固醇類，而磷脂質又分別由卵磷脂(70％)、腦磷脂(25％)及神經磷脂(2.3％)所組成(林，1983)，是以理論上卵磷脂約佔生鮮卵黃的6.8％，為豐富的卵磷脂來源。表2顯示，自不同處理方式的雞卵黃萃出粗卵磷脂收率，雖以水煮卵黃的4.55％最高，但生鮮、冷凍、鹹卵黃各組亦在4.11％以上，可見這四種原料處理對粗卵磷脂萃出率影響不大；然而，未能自卵黃油萃得粗卵磷脂，顯示卵黃油萃取用的正已烷並未將卵磷脂同時溶出；由於卵磷脂僅微溶於苯(Windholz, 1983)，而正已烷非極性與苯相近(Lehniger, 1982)，所以卵磷脂未能隨卵黃油萃出。
表2. 雞卵黃處理方式對粗卵磷脂萃出率的影響
| Treatments | Wt of crude phosphatide(g) | Yield of crude phosphatide(％)* |
| Fresh Yolk oil Lyophilized Cooked Salted |
22.37±3.25 none 21.50±4.93 22.82±3.07 20.93±5.47 |
4.46±0.64 none 4.30±0.56 4.55±0.89 4.11±0.98 |
| *Yied％＝(wt of crude phosphatide／wt of raw yolk)×100 **Applied sample：500 g／batch |
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Ⅲ、粗卵磷脂之三氧化二鋁管柱層析
卵磷脂分子上之烷基、磷酸基及膽鹼是決定其化學功能性因子(Windholz, 1983)，而磷酸基與膽鹼的存現，可能使卵磷脂易吸附於三氧化二鋁(Heftmann, 1975)。粗卵磷脂於三氧化二鋁管柱層析份化(表3)，依溶出液色澤及清濁度，計收集11個份化，每一份化配合薄層分析做成分初步鑑定，得悉由第2至11份化均有卵磷脂被溶洗出來，其中2、3、4三個份化顯著較具同質性(homogeneous)，且染色時呈Dragendorff陽性，其層析份化收率(chromatographed fraction yield)合計45％，總份化收率(overall yield of fraction)為1.99％。此純化卵磷脂外觀呈淡黃色，一如Windholz(1983)所述。第5至11份化仍含有卵磷脂，但非同質性(non-homogeneous)增加，可能另含中性脂質、Lysophosphatide及其他磷脂質成分。
表3. 雞蛋粗卵磷脂之三氧化二鋁管柱份化
| Fraction | Fraction volume(ml) | Appearance | Fraction wt(g) | Chromatographedc fraction yield(％) | Overalld yield of fraction(％) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
324±57 270±40 14±1 14±1 14±2 361±28 33±4 132±3 18±2 133±19 198±16 |
clear, colorless hazy, yellowish cloudy,yellowish hazy,yellowish clear,colorless clear,colorless cloudy,yellowish hazy,yellowish cloudy,yellowish hazy,yellowish cloudy,yellowish |
0.38 4.08 4.01 3.04 5.39 1.92 1.99 0.38 0.21 0.91 0.91 |
1.52 16.32 16.04 12.16 21.56 7.68 7.96 1.52 0.84 3.46 3.46 |
0.07 0.73 0.72 0.54 0.96 0.34 0.35 0.07 0.04 0.16 0.16 |
| a. Conditions：column size 4cm×87cm, eluent chloroform：methanol
19：1, applied sample 25g／batch b. Data in the table represent means of 3 replicates. c. Yield based on wt of crude phosphatidesapplied to column. d. Yield based on starting wt of yolk. |
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Ⅳ、卵磷脂之脂肪酸組成
同脂性卵磷脂藉GC測定其脂肪酸，試樣卵磷脂與標準品之氣相色層分析圖相似，然18C以上脂肪酸(主要為硬脂酸、油酸及亞麻仁油酸)(Singleton et al., 1965)則未能成功分離。將各波峰經積分儀計算其分佈比例，得悉粗卵磷脂與純化卵磷脂脂肪酸組成特性不同(表4)，就量而言，粗卵磷脂以14：0(1.96)16：0(23.85％)、16：1(3.98％)及18C以上的54.38％為主；純化卵磷脂，無論試樣或標準品，則以14：0、16：0及18C以上三類脂肪酸為主，其中16：0與18C以上合計更達81~83％，且兩者組成比例相似；此一結果與Singleton et al., (1965)所獲雞蛋卵磷脂脂肪酸之16：0與、37.7％、18C以上59.1％，亦甚接近，然與大豆卵磷脂(Windholz, 1983)之16：0、11.7％、16：1、8.6％及18C以上78％，則有顯著差異。
表4. 雞卵黃油、粗卵磷脂及純化卵磷脂之主要脂肪酸組成
| Samples | 4：0 | 6：0 | 8：0 | 10：0 | 12：0 | 14：0 | 16：0 | 16：1 | 18：0,1,2 |
| ％ | |||||||||
| Yolk oil
Crude lecithin Purified lecithin Authentic lecithin |
0.10 ±0.04 0.11 ±0.01 0.13 ±0.04 0.62 ±0.11 |
0.35 ±0.21 0.81 ±0.15 0.44 ±0.14 2.06 ±0.62 |
0.12 ±0.09 0.36 ±0.16 0.12 ±0.02 0.85 ±0.14 |
0.11 ±0.07 0.02 ±0.01 0.23 ±0.06 0.09 ±0.03 |
0.03 ±0.20 0.34 ±0.02 0.12 ±0.01 0.28 ±0.07 |
0.75 ±0.20 1.96 ±0.69 2.71 ±0.38 1.93 ±0.51 |
30.12 ±1.33 23.85 ±0.23 32.62 ±0.23 31.86 ±0.36 |
0.24 ±0.11 3.98 ±3.32 0.40 ±0.07 0.97 ±0.10 |
65.75 ±3.23 54.38 ±8.23 51.27 ±2.05 50.98 ±2.45 |
Ⅴ、卵磷脂之IR光譜鑑定
第2、3、4份化卵磷脂之IR圖譜，大致同於標準品者，其中碳基(-CO-, 1715cm-1)及胺基(-NH2, 1640cm-1)的存現(Nakanishi, 1976, Silverstein, 1977)，更是確認卵磷脂重要佐證，蓋此兩官能基毗鄰而現，正意味試樣中含有膽鹼(Windholz 1983)。
綜上所述，藉丙酮沉澱，乙醇、石油醚溶解，約可自雞卵黃萃得4.3％粗卵磷脂，粗卵磷脂經三氧化二鋁管柱氯仿：甲醇(9：1)溶洗液層析，可純化出高同質性卵磷脂約2％，純化效率值得定；如擬工業化應用，應予回收有機溶媒方合乎經濟效益。
誌謝
試驗承台灣省畜產試驗所加工系林月娥，蔡麗卿兩位小姐協助，謹此申請。
參考文獻從略。
飼料營養雜誌(p.81∼89)─王政騰.梁逸、九四年第二期