生菌劑與抗菌性
飼料添加物併用之影響
家畜之腸內菌叢，對生產有密切關連性，正常維持腸內菌叢，繫及家畜之疾病預防、生產提昇。飼料用生菌劑，由於安全性較高，以維持腸內菌叢之平衡，提高生產性能為目的，在添加於飼料，最近定義作Probiotics，影響腸內菌叢或宿主之種種作用備受注目。
但另方面，因是生菌原故，對抗菌性物質有感受性。併用投與有感受性之抗菌性物質與生菌劑之際，若生菌在動物消化管內死滅，就不能發揮Probiotics之作用。
對於clostridium butyricum Miyairi菌，為要調查對飼料添加物既指定之抗菌性物質之感受性，測定最小發育阻止濃度，再者，對於有感受性之抗菌性飼料添加物，使用鼠(Rat)，實施與Miyairi菌之併用投與試驗。
一、材料及方法
1. Miyairi菌之最小發育阻止濃度(MIC)之測定
(1)試驗方法
遵照嫌氣性菌之MIC測定法，依瓊脂平板稀釋法測定。使用變法GAM瓊脂培養基，作基礎培養基，調製以100 mg／ml為中心之2倍稀釋液，至0.025 mg／ml之13階段濃度之各藥劑添加培養基。以在GAM肉汁37℃ 24小時增菌之Miyairi菌，使用白金耳畫線塗抹於此平板培養基，急速培養。
使用嫌氣性globebox(平澤ANX1，使用混合氣體N2：CO2：H2＝80：10：10)，施行37℃，24小時及48小時培養後之二次判定，肉眼可明顯看到阻止發育之最低濃度，作為MIC。
遵照飼料安全性試驗法之力價試驗項目，溶解抗菌性物質，作為試料溶液。又，確認使用於溶解之溶媒中，Miyairi菌也會發育。由以上之方法，對各藥劑施行2次以上之同樣試驗，求Miyairi菌對抗菌性物質之MIC值。
(2)供試藥劑
有bacitracin鋅，abiramycin, abopalcin, alkyltrimetylammoniu-mcalcium tetracycline, efrotomycin, enromycin, kitamycin, chlorotetracy-cline, salinomycin Na, thiopeptin,testomycin A, nociheptide, hyglomycin B, virginiamycin, bicosamycin, flavophosphoripol, polynactin, monesin Na, vasarocido Na, clistin硫酸，tylosin磷酸, amplorium, etopabet, salphaquinoxalin, orakicidox, molantel檸檬酸，decokinet, nicarbagin, halofugion-polysty renesulphurate鈣，共29種藥劑(使用日本科學飼料協會及東京肥料檢查，配佈之標準製劑)。
2. Miyairi菌與抗菌性飼料添加物併用投與試驗
(1)供試動物及供試飼料
Jcl：使用計15匹之Wistar系rat♀(日本krea，5週齡時開始)。給與CE─2粉末飼料(日本krea)。
(2)試驗設定及試驗時間表
遵照飼料添加物之評價基準及其試驗方法，行試驗設定(圖1)。
供試老鼠逢機分成1群5隻之3群，在5連籠(日本krea)單飼，採自由攝取飼料及水，為要防止食糞，敷設金網，使所排泄之糞便落下，再者為要防止飼料等污染Miyairi菌，各群籠設置間壁，開始1週之預備飼育後試驗
Miyairi菌及抗菌性飼料添加，為添加於粉末飼料，連續經口投與。Miyairi菌為約105 cfu／g飼料，抗菌性飼料添加物，以所見量之最高量，各別均一加於飼料中充分攪拌、混合。併用投與期間為7日以上，Miyairi菌投與後，糞便中之菌數成一定後，開始併用試驗。以上之試驗作為一段落，以7天以上之間隔，供下次之試驗段落。
(3)糞便中Miyairi菌之測定方法
採取新鮮糞便後，以嫌氣性菌用稀釋液，行10倍階段稀釋，各稀釋倍液之規定量，滴於Miyairi菌選擇培養基，以conlage棒塗抹。在嫌氣性globe box，行37℃，24小時嫌氣性培養。培養後，計測所出現之Miyairi菌之菌落數，換算1g糞便之菌數。又，Miyairi菌之同定為，檢查對Miyairi菌有特異作用之噬菌KMI，有否感受性施行。
(4)觀察事項
Miyairi菌投與開始後，每天採取糞便，確認1g糞便中Miyairi菌之菌數，成一定。又，糞便中之菌成一定之事是，由3次以上連續檢出同程度之菌數來確認。
抗菌性飼料添加物併用投與期間中，星期六、星期天除外，每天採取糞便，測定Miyairi菌之菌數。
(5)供試藥劑
系統別的分別抗菌性物質，對於Miyairi菌之MIC測定之結果感受性，利用同系統之代表性下記抗菌性物質，實施在活體內試驗。
磷酸tyrocin, bacitracin鋅, enramycin, abopalcin, varginiamycin, flavophosphoribol, salinomycin Na, chlorotetracycline, efrotomycin, nociheptide, orakindox, decokinet 12種藥劑。
二、試驗結果
1. Miyairi菌對抗菌性飼料添加物MIC
結果如表1所示。
(1)MIC 50μg力價／ml以上之抗生素有colistin硫酸，bicozawycin, destomycin A, hyglomycin B, amprolium, eterpabet, sulfaquinoxaline, 檸檬酸 molantel, halofugi nopolistylen sulphurate鈣，9種藥劑。
(2)MIC未滿50μg力價／ml之抗生素
對其他20種藥劑有感受性，尤其對thiopeptin, nosiheptide，為0.025μg力價／ml以下，有高感受性。
表1. 抗生素飼料添加物對Miyairi菌之最小發育阻止濃度(MIC)(依瓊脂平板稀釋法)
| 系統 | 抗生素名 | MIC(μg力價／ml) |
| 巨環系
|
Kitasamycin 磷酸 tyrosin |
0.78 0.20 |
| polypptide系 (多縮胺基酸)
|
Bacitracin鋅 enramycin thiopeptin colistin硫酸 |
0.20 0.39 0.025以下 200以上 |
| glytspeptide系 peptide系 其他peptide系 多醣類 多醚系
|
abopalucin virginiamycin bicosamycin flavophospholipol salinomycin Na Moenensin Na lasarocide Na |
0.05 0.39 50 25 0.78 1.56 1.56 |
| aminozlycoside系
|
destomycin hygromycin─B |
200以上 200以上 |
| Tetracycline系
|
alkyl triethyl ammouium Ca oxytetracycline chlortetracycline |
0.05
0.10 |
| 其他
|
abiramycine efrotmycin nosiheptide Polynakthin |
0.10 0.05 0.025以下 1.56 |
| 合成抗菌劑
|
amprolium etorapet sulfaquinoxaline orakindox 檸檬酸 molantel decoquinate Nicarbagin halofuginon polysty-renesulphnrate Ca |
200以上 200以上 100 1.56 200以上 12.5 6.25 200以上 |
2. Miyairi菌與抗生素併用投與試驗
(1)抗生素投與前糞便中Miyairi菌之菌數
表2示出其結果，添加於飼料之Miyairi菌之菌數，為6.9×105 cuf／g飼料(n＝12，平均值)。Miyairi菌為自投與開始後第1天檢出，常在105 cfu／g糞便前後安定之菌數，被檢出，回收。
(2)抗生素投與後，糞便中Miyairi菌之菌數
結果同樣示於表2。即使投與所見之各別抗生素量之最高量，檢出同於併用投與前之菌數。又，如nociheptide對在試管內有高感受性之抗生素，糞使中Miyairi菌之菌數，沒有減少，可安定檢出。
表2. Miyairi菌與抗菌性飼料添加物併用投與試驗
平均值±標準偏差㏒ cfu／g糞，n＝5) |
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| 供試抗菌性飼料添加物之系統及種類 | 對Miyairi菌之MIC(μg力價／ml) | 抗菌性飼料添加物之投與量(ppm)* | Miyairi菌之投與量cfu／g飼料 | 備註 |
| 巨環系 tyrosin磷酸 |
0.20 | 44 | 6.9×105 | |
| 多縮胺基酸 bacitracin Zn cnramycin |
0.20 0.39 |
420萬單位／ton飼料20 | 6.9×105 6.8×105 |
(8天後) (5.1±0.1) |
| glycopeptide系 abovalsin |
0.05 | 20 | 7.5×105 | (11天後) (5.0±0.1) |
| 縮胺基酸系 virginiamycin |
0.39 | 20 | 6.9×105 | |
| 多醣類系 flavophospholipol |
25 | 10 | 6.8×105 | (8天後) (5.0±0.1) |
| 多醚類系 salinomycin Na |
0.78 | 50 | 6.5×105 | |
| tctracycline系 cholortetracy-cline |
0.10 | 55 | 6.8×105 | |
| 其他 efrotomycin nociheptide |
0.05 ＜0.025 |
16 20 |
7.5×105 7.5×105 |
(11天後) 4.8±0.1 4.9±0.1 |
| 合成抗菌劑 oraqunidoxs decokinet |
1.56 12.5 |
50 40 |
6.5×105 6.5×105 |
|
| 供試抗菌性飼料添加物之系統及種類 | Rat糞便中Miyairi菌之檢出菌數 | ||||||||
| 抗菌劑投與前(Miyairi菌投與) | 抗菌劑投與後(Miyairi菌+抗菌劑投與) | ||||||||
| 1天後 | 2天後 | 3天後 | 4天後 | 1天後 | 2-4天後 | 5天後 | 6天後 | 7天後 | |
| 巨環系 tyrosin磷酸 |
4.8±0.4 | 5.0±0.1 | 4.8±0.2 | 4.9±0.2 | 4.8±0.1 | 4.5±0.3 | 4.6±0.2 | 4.6±0.2 | 4.6±0.1 |
| 多縮胺基酸 bacitracin Zn cnramycin |
4.8±0.5 5.1±0.3 |
4.9±0.7 5.1±0.1 |
4.9±0.2 5.2±0.1 |
4.8±0.3 | 4.8±0.2 5.1±0.1 |
4.6±0.1 5.1±0.1 |
4.5±0.2 5.1±0.1 |
4.7±0.1 5.0±0.1 |
4.7±0.1 5.1±0.1 |
| glycopeptide系 abovalsin |
5.1±0.1 | 5.1±0.1 | 5.2±0.1 | 5.2±0.1 | 5.1±0.1 | 5.0±0.2 | 5.1±0.1 | 5.1±0.2 | 5.0±0.2 |
| 縮胺基酸系 virginiamycin |
4.7±0.3 | 4.9±0.2 | 4.9±0.3 | 4.8±0.2 | 4.8±0.1 | 4.9±0.1 | 4.5±0.1 | 4.5±0.1 | 4.6±0.1 |
| 多醣類系 flavophospholipol |
5.2±0.2 | 5.1±0.1 | 5.2±0.1 | 5.3±0.1 | 5.1±0 | 5.1±0.1 | 5.0±0.1 | 5.1±0.1 | |
| 多醚類系 salinomycin Na |
5.2±0.2 | 5.3±0.1 | 5.1±0.1 | 5.2±0.1 | 5.2±0 | 5.2±0.2 | 5.2±0.1 | 5.1±0.1 | |
| tctracycline系 cholortetracy-cline |
5.0±0.2 | 5.1±0.0 | 5.1±0.1 | 4.8±0.4 | 4.3±0.4 | 4.4±0.2 | 4.5±0.1 | 4.3±0.3 | |
| 其他 efrotomycin nociheptide |
5.2±0.2 5.2±0.1 |
5.2±0.0 5.1±0.2 |
5.2±0 5.1±0.2 |
5.0±0 5.1±0.2 |
5.2±0.1 5.0±0.1 |
5.0±0.1 5.0±0.1 |
4.9±0.1 5.0±0 |
4.9±0.2 5.0±0.1 |
4.9±0.1 5.0±0.3 |
| 合成抗菌劑 oraqunidoxs decokinet |
5.1±0.2 5.0±0.1 |
5.2±0.2 5.1±0.1 |
5.3±0.2 5.2±0.1 |
5.2±0.1 5.2±0.1 |
5.2±0.2 5.2±0.1 |
5.2±0.1 5.1±0.2 |
5.0±0.1 5.1±0.1 |
5.0±0.1 5.2±0.1 |
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＊：抗菌性飼料添加物為投與認為量之最高量 |
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三、討論
某細菌對抗生素有否感受性之評價，非絕對性，徹底非相對性之物。因藥劑引致之不同，或生體內之吸收、分佈等，影響抗菌力之條件複雜，要自MIC值簡單判斷感受性或非感受性(break point)，有其困難，本次自抗菌性物質對飼料之添加量，大約為10 μg／g飼料，及所謂耐性菌時之標準，為MIC值2.5 μg／ml以上等，判定50 μg力價／ml以上之MIC值為非感受性。
自1976年施行有關「飼料之安全性確保及品質改善」之法律(飼料安全法)以來，便嚴格規定抗生素對飼料之添加。但，適當使用之抗生素評價，一點也不能否定，要預防家畜之疾病及治療，抗生素為不可或缺，實際上，有很多與生菌劑併用投與。關於各種生菌劑與抗生素併用投與之際之影響，幾乎沒有發表之資料且不明。
在本次之試驗，僅行一種抗生素與Miyairi菌併用投與，沒有實施複數抗生素與Miyairi菌之併用試驗。但考慮及(1)即使併用有高感受性之抗生素量之最高量，幾乎不減少糞便中Miyairi菌之檢出菌數，(2)動物用抗生素，自消化道之吸收多半較少，儘管在消化道內，長時間與Miyairi菌接觸，檢出菌數不減少及(3)細菌芽胞之安定性等，即使併用投與複數抗生素，可見不會影響Miyairi菌之檢出菌數。
又，儘管在試管內有感受性，即使併用投與，糞便中Miyairi菌之菌數不減少之理由是，(1)芽胞對抗生素之安定性，(2)所投與之抗生素，在消化道內之分佈濃度，由於自消化道之吸收或依內容物變薄，成MIC值以下，(3)抗生素在消化道分佈之部位，與Miyairi菌發育增殖之部位不同等。
添加抗生素於飼料，對家畜之發育促進效果及感染症，有預防效果之外，也有攪亂腸內菌叢，殘留於畜產物，明顯增加耐性菌及藥劑耐性之傳達等，很多問題。在生菌劑雖沒有這種問題，但有必要研究，解明Probiotics之有效性及作用機轉等。
四、彙總
為要調查Miyairi菌對飼料添加物與指定之抗生素感受性，使用瓊脂平板稀釋法，測定最小發育阻止濃度(MIC)，再者，使用Rat，以判定有感受性之20種抗生素中，同系統之代表性物12種，各別行與Miyairi菌併用投與，測定糞便中Miyairi菌之菌數，調查其影響。抗生素之投與量，為各別所見量之最高量，其結果：
(1)Miyairi菌對硫酸colistin, bicosamycin, destomycin A, hyglomycin B, amprolium, eterpabet, sulphaquinoxaline, 檸檬酸 molantel, halofuginopolystylen sulphurate鈣，為非感受性。對本試驗所使用之其他20種抗生素有感受性。
(2)雖Miyairi菌與有感受性之抗生素併用投與，糞便中之菌數並不減少，且可安定檢出。亦即，確認即使與在試管內有高感受性之抗生素併用，在動物消化管內，並不死滅。
飼料營養雜誌(p.73∼80)─陳厚基、九七年九期