培养液中添加不同动物之血清与不同浓度
之牛血清蛋白对山羊精子在体外
培养时活力之维持效果
摘要
本研究旨在比较培养液中，含不同浓度之牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)与不同动物血清(blood scrum)，对维持体外培养之山羊精子，具有良好活力之效果。
山羊之射出精液，先於20℃被静置4小时後，再经3次洗涤与离心(600-800xg，3分钟)，将其精浆移除，俾令精子完成获能作用。此等经体外获能之精子，分别被悬浮於含0.4、0.8、1.2、1.6与3.2％(w／v)等，5组不同BSA浓度之体外受精培养液中，并於39℃，含5％CO2及95％空气与100％相对湿度之条件下，予以体外培养0~8小时。各组精子之活力，并於培养终了时，分别予以取样评估之。试验结果显示，当培养液中BSA之添加量少於1.2％时，精子经体外培养6小时後，具良好活力之精子百分率，均低於50％。反之，提高溶液中BSA浓度至1.6％或3.2％，则精子甚至在体外被培养8小时後，分别仍有70％与80％系具有良好活力者，且均显着优於BSA之添加量0.8％或以下者(P＜0.05)。显示在山羊之体外受精培养液中，BSA之添加量应不得少於1.6％甚或3.2％。
另外於前述培养液中，额外添加20％(v／v)不同动物来源之血清，包括山羊血清(goat serum)、胎犊血清(fetal calf serum)与猪血清(porcine serum)等，比较其对体外培养之山羊精子，良好活力之维持效果。试验结果显示，山羊精子在含有1.6％(w／v)BSA与20％(v／v)山羊血清之培养液中，被体外培养4小时後，尚能维持85％之精子具有良好活力；反之，使用相同添加量之猪血清取代山羊血清时，则精子经2小时之体外培养後，活力急降至50％以下(P＜0.05)。尤有甚者，当培养液中之山羊血清，被以相同浓度之胎犊血清取代时，则山羊精子於2小时内全体死亡。足见，山羊精子活力之体外维持，受培养液中添加血清之源自於不同动物，影响甚钜。(关键语：山羊精子、精子活力、牛血清白蛋白、血清)
绪言
在进行体外受精试验时，最常遭遇之困难，乃在体外培养过程中，不易维持好之精子活力。新鲜射出精液，其精子必需在雌性生殖道中先停留一段时间，俟完成获能作用(capactitation)与头巾反应(acrosome reaction)後，始具有钻入卵母细胞内，产生正常受精作用之能力(Austin, 1951；Chang, 1951)。因此在进行哺乳动物之体外受精试验时，常需模仿体内之生理状况，先於体外诱发精子产生获能作用。新近之研究结果显示，新鲜射出精液於室温(20℃)下被静置一段时间後，再应用适当溶液，进行一系列之精子洗涤与离心，俾移除其精浆成分，可使精子完成其获能作用(Iritani et al., 1984；Cheng, 1985)。惟经前述处理後之精子，於进一步之体外培养过程中，常无法维持其良好之活力。致获能作用虽已被完成，精子亦无法钻过卵丘细胞群(cumulus cell mass)与透明带(zona pellucida)，故未能顺利进入卵母细胞内，俾产生其正常之受精作用(Fraser, 1981；1983；1984)。
许多因素，包括：培养温度(Mahi and Yanagimachi, 1973)、培养液之pH值(Bavister, 1969；Miyamoto et al., 1974)与培养液之组成成分，如钙离子之浓度(Frasher, 1982)、兴奋精子产生超活力(superactivity)作用物质之添加与否(Leibfried and Bavister, 1981；1982)、血清白蛋白之添加量(Yanagimachi, 1970)及使用何种动物之血清(Cheng, 1988)等，已知可显着影响精子之体外获能作用、获能精子之活力与受精力。本试验乃针对山羊精子於体外被培养时，比较培养液中牛血清白蛋白之添加量与添加不同动物之血清，对精子活力之维持效果；冀能提供做为建立山羊体外受精系统之参考。
材料与方法
本试验使用之山羊精液，均系应用人工假阴道所集者。山羊精子之体外获能方法，则依照Cheng(1988)所述，并略经适当修饰。主要乃令山羊精液先於20℃下静置4小时，再应用受精用培养液(pH＝7.8)，举行三次洗涤与离心，俾移去精浆部份。其处理要点如后：第一次取0.5ml山羊精液，与2.5ml之受精用培养液(pH＝7.8)相混合，经使用吸管反覆予以轻柔洗涤後，以600xg离心3分钟，然後取上层液2ml与前述培养液3ml混合，举行第二次洗涤，并经800xg离心3分钟，移弃上层液；下层之精子沈淀颗粒，则被悬浮於3ml之前述培养液中，举行第3次洗涤，再以600xg离心3分钟。精子悬浮液於第3次离心後，取用上层液2ml，经检查精子活力并计算精子浓度，然後应用受精培养液(pH＝7.4)，调整精子浓度至每ml含有5×107个精子，俾供进行体外培养试验。
前述受精用培养液之配制，乃於每毫升TCM199中，添加0.1mg丙酮酸钠(sodium pyruvate)、0.9mg乳酸钙(calcium lactate)、2.5mgD─葡萄糖(D─glucose)、0.1mg抗生素(i.e. Dibekacin sulfate)与20％(v／v)山羊血清(goat serum，GS；Gibco 200-6210AG)及1.6％(w／v)牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA；Fraction V, SIGMA Ltd.)等，配制而成者。惟当比较不同BSA浓度，对维持良好精子活力之影响时，则其BSA之添加量分别为0.4、0.8、1.2、1.6与3.2％不等。另外，在比较不同种别来源之血清，对於良好精子活力之维持效果时，则以20％(v／v)之胎犊血清(fetal calf serum, FCS；Gibco 200-6140 AG)与(或)猪血清(porcine serum, PS；Gibco 200-6250 AG)，取代前述之山羊血清；所有血清在使用前均经56℃予以热不活化(heat inactivated)处理30分钟。在该2试验中，业经体外获能处理之山羊精子，系被分别悬浮於各特定培养液中，并调整精子浓度至每毫升5×107个精子。此等完成稀释之精子悬浮液，仍分别被置於39℃、5％二氧化碳、95％空气与95~100％相对湿度等条件下，进行体外培养0~18小时；每隔2小时并分别采取各精子样本，置於位相差显微镜下，检查并比较在培养过程中，精子活力之变化情形。
精子活力之检查，系将混合均匀之各组精液样品，分别以玻棒各沾取各一小滴置於载玻片上，分别经盖上盖玻片後，再置於检查精子活力用之恒温器(FHK Equipments, Japan)平台上，应用低倍(×150)位相差显微镜，分别观察并详实记录其呈现前进式游动之精子百分数。各不同试验组间，所有观察值亦即百分值，均先转角度後，再应用Student's t-test分析并比较其统计上之显着差异性，最後再转回百分值表示於文中。
结果与讨论
图1与图2分别为业经体外获能之山羊精子，在添加有不同浓度之BSA与不同动物来源血清之培养液中，被举行体外培养时，其精子活力之变化情形。由图1所显示，当培养液中BSA之添加量在1.2％或以下时，精子经6小时体外培养後，其拥有良好活力之精子百分率，急遽降至50％以下；反之，应用含1.6％与3.2％BSA之培养液者，经体外培养8小时後，具有良好活力之精子百分率，则分别为70％与80％。鉴於在举行猪卵、牛卵与绵羊卵之体外受精试验时，卵母细胞务必与该动物之获能精子，共同於体外至少被培养6~8小时，且在该体外培养期间中，精子必需始终保持良好之活动力，方能获有较佳之受精结果(Cheng，1985)；精子在受精过程中，良好活力之维持，乃系使精子成功钻入卵母细胞所不可或缺者(Fraser，1981，1983，1984，Rogers，1983)。本试验结果充分显示，在进行山羊卵之体外受精时，其培养液中BSA之添加量，至少应以1.6％为宜。据Yanagimachi(1969，1970)与Bavister(1975)指称，牛之血清蛋白中，存在一种对热安定之小分子物质，称之为"精子活力之因子(sperm motility factor, SMF)"。因此，当培养液中添加BSA时，对多种动物包括小鼠(Miyamoto and Chang 1973；Hoppe and Whitten, 1974)、兔(Davis，1976)与仓鼠(Bavister, 1981)等之精子活力，具有良好之维持效果。此外，BSA中亦被指称含有一种大分子物质，可诱发精子产生获能作用；特别对小鼠、兔与仓鼠等动物之精子，BSA已知系其在体外完成获能作用所不可或缺者(Miyamoto and Chang, 1973；Hoppe and Whitten, 1974；Davis, 1976；Bavister, 1981)。尤有甚者，BSA对於完成获能作用能之精子，更有刺激其产生头巾反应之作用(Meizel, 1978；Bavister, 1986)。BSA是否需与精子细胞膜有直接之接触，方能诱发获能作用与头巾反应之产生，虽迄未被充分肯定，惟Dow and Bavister(1989)曾有一特殊设计，系应用透析膜将腔室分隔为二，俾使BSA与精子能被分开培养，致精子无法与BSA有直接之接触。结果证明当仓鼠精子未与BSA直接触时，其获能作用与头巾反应均无从发生；反之，当仓鼠精子与BSA系被直接接触培养时，则能完成其获能作用与头巾反应。
牛血清白蛋白系如何参与精子之获能作用及头巾反应，其详细机构虽迄未有明；惟精子之细胞膜与雄性生殖道之分泌物中，均曾被发现有高浓度之锌离子与胆固醇，可稳定精子之细胞膜(Aonuma et al., 1978；Andrews and Bavister, 1989)。职是之故，精子之获能作用，可能亦涉及锌离子与胆固醇之移除；一旦此等具有安定细胞膜之物质被移除後，精子之浆膜(plasma membrane)将与头巾外膜(outer acrosomemembrane)发生融合作用并形成空泡化(vesiculization)，头巾鶣逐得以顺利被释出(Yanagimachi, 1981)。鉴於BSA已知对胆固醇与锌离子均极具结合力，因此推测BSA对於自精子之细胞膜移去该二物质，扮有重要之角色(Peter, 1975；Aonuma et al., 1978)。
本试验之结果(图2)亦显示，培养液中添加不同动物来源之血清，对山羊精子活力之维持影响甚钜。山羊精子在含有1.6％(W／v)BSA与20％(V／V)GS之培养液中，被体外培养4小时後，其具有良好活力之精子百分率，尚能维持85％；反之，以20％(v／v)之猪血清取代山羊血清，则精子活力於体外培养2小时内，急遽降至50％以下。尤有甚者，当应用20％(v／v)之FCS取代GS时，则山羊精子於2小时内，全体死亡。足见FCS对山羊精子极具毒性；类似之结果，亦见之於Cheng(1988)在绵羊卵所举行之体外受精试验中，绵羊精子一旦被悬浮於含20％(v／v)FCS之培养液後，其活动力可在5分钟内完全丧失。此等结果无异显示，不同动物之精子，对於不同动物来源之血清，缺乏耐受力。
综合本试验结果，山羊射出精子在20℃下静置4小时，并经3次洗涤与离心後，虽可完成体外获能作用；惟当进一步被应用以举行体外受精时，应在其培养液中，添加至少1.6％(w／v)之BSA与20％(v／v)之GS，始能维持良好之精子活力。(参考文献略)(转载自中国畜牧学会会志)
饲料营养杂志(p.96~101)─林佳静．九三年第九期