人工瘤胃(in Vitro)法评估山羊日粮中

添加粕酵鸡粪对瘤胃性状之影响

摘要

        家禽排泄物中含有丰富的粗蛋白质，总可消化营养分及钙、磷等成分可作为反刍动物氮素与能量来源。本试验以连续性粕酵装置，利用羊只饲养试验之日粮分别添加粕酵鸡粪(含鸡粪70％乾物)0、15、30及45％等四组，并调制成粒状完全日粮进入人工瘤胃之消化以探讨利用连续装置评估瘤胃液性状的可行性。经培养测定的结果显示：氨态氮之浓度各组分别为10.0、11.0、13.0及13.0mg／100ml，30％及45％组显着高於0％及15％组(P＜0.05)。总挥发性脂肪酸浓度分别为139.35、113.14、98.03及86.80 mmole／l，0％组显着高於其他三组(P＜0.05)。个别挥发性脂肪酸的摩尔百分比；乙酸：45％组显着较15％组为高(P＜0.05)。丙酸：0％与15％组显着高於30％及45％组(P＜0.05)。丁酸：30％及45％组显着高於0％及15％组(P＜0.05)。异丁酸：45％显着高於0％及15％组(P＜0.05)。戊酸：15％组显着高於0％组(P＜0.05)。异戊酸：各组间皆无显着影响(P＞0.05)。乙酸／丙酸的比例分别为0.92、0.86、1.00及1.47；45％组显着高於其他三组(P＜0.05)。人工培养瘤胃液粗蛋白质含量依次为19.58、20.53、19.90及17.97％；45％组显着较前三组为低(P＜0.05)。总胺基酸含量分别为15.45、15.29、15.19及13.75％；45％组显着较0％组为低(P＜0.05)。个别胺基酸中天门冬胺酸、麸胺酸及白胺酸的含量以45％组显着低於前三组(P＜0.05)。脯胺酸、缬胺酸及苯丙胺酸的含量以45％组显着低於0％及15％组(P＜0.05)。甲硫胺酸及酥胺酸的含量以45％组显着低於0％组(P＜0.05)。其他各种胺基酸的含量皆无显着影响(P＞0.05)。

        关键词：山羊、粕酵鸡粪、连续性粕酵器、氨态氮、挥发性脂肪酸、胺基酸。

绪言

        台湾地区幅员不大，可耕地面积有限，每年生产杂粮不多，仅占畜牧事业所需6.3％，其馀之饲料皆仰赖进口，每年花费大笔外汇购买杂粮供应畜牧生产，是畜牧事业成本居高不下之原因。由於畜牧经营规模扩大，大量禽畜排泄物已经严重影响国人生活品质，社会大众环保意识提高，畜牧公害广被重视，因此畜牧生产应该使污染减至最低。

        禽畜排泄物循环再利用(recycling)的研究甚多，证实适当的加工处理，取代部份日粮可以降低饲料费用。Fontenot(1982)比较各种禽畜排泄物的营养价值，以鸡的排泄物营养分最高。Smith and Wheeler(1979)以禽畜排泄物添加12~24％饲养肥育牛，日增重达0.90~1.16Kg，显示达到很好的增重。反刍动物可以更有效的利用禽畜排泄物当做能量和蛋白质来源，(Bhattacharya and Taylor 1975)。Trung(1988)指出乳牛以鸡排泄物取代23％日粮，可以节省30％饲料费用，增加37％收入。粕酵鸡粪可以提高适口性，增加采食量(Caswell et al., 1977；Goering and Smith, 1977；Harmon et al., 1975a, b)。McCaskey and Wang(1983)试验指出，青贮之水分为40％时可以在3~5日内杀灭大肠杆菌(E. Coli)及沙门氏菌(Samonella)等微生物，而家禽排泄物所含寄生 无传染给反刍动物之顾虑，且寄生 可藉由加工方法杀灭，同时青贮可以提高氮的利用率及减少氮的损失(Newton et al., 1977)。Westing et al., (1985 a, b)以原子吸光仪测定鸡排泄物的43种矿物质，发现含量均较对照组为高，以此排泄物再饲养牛、羊，结果不会影响动物生长，屠体亦不会影响人类健康。因此世界粮农组织规定屠宰前必须有15~30天的停用期，而建立适当的停用期是可以保障禽畜排泄物的安全使用(Taylor and Geyer, 1979)。

        影响瘤胃总挥发性脂肪酸(volatile fatty acid；VFA)浓度及个别VFA molar ％之因素甚多。Church(1979)指出VFA之量可以反应出微生物之活力，给予适当环境期营养时，可以使微生物活力增加，而瘤胃吸收功能达到高峰。因此饲养反刍动物的基本原则为了解瘤胃生理功能，给予良好的粕酵环境才可以达到最高的生产能力。个别VFA molar％与摄食日粮成分有关，日粮中粗料比例增加，则乙酸(acetic acid；C₂)molar％升高，丙酸(propionic acid；C₃)及戊酸(valeric acid；C₅)的molar％相对降低(和泉与西 1974, 1979)。

        家禽排泄物中含有丰富的氮源，估计粗蛋白质占28~31.3％，其中真蛋白质占11.3~16.7％(Fontenot, 1982)。瘤胃微生物可以利用不同的氮源合成必需的胺基酸(Allison, 1969)。但以非蛋白态氮合成胺基酸是不足高产反刍动物之需(Huber and Kung, 1981)。家禽排泄物中含有高量非蛋白态氮，其中尿酸态氮占总氮的30~60％，进入瘤胃後迅速被分解成氨态氮(Bhattacharya and Taylor, 1975)。因此添加高量的EDPW会影响氨态氮之浓度(Caswell et al., 1975、1977、1978；Goering and Smith, 1977及Lucase et al., 1975)。Stern and Hoover(1979)指出瘤胃菌体蛋白质(bacteria crude protein；BCP)合成能力与日粮中碳水化合物及氮源有关，因此添加高量的EDPW会影响BCP的合成量，进而影响胺基酸的产量。

        本试验为利用连续性粕酵器，藉其精密控制粕酵之进行；探讨不同EDPW添加量对瘤胃粕酵性状影响，进而探讨蛋白质及胺基酸合成能力，做为禽畜排泄物饲料化之参考。

材料与方法

        Ⅰ、试验材料

        (1)粕酵鸡粪(Ensiled dry poultry waste；EDPW)制备：

        购自商业蛋鸡场日晒乾燥鸡粪(dry poultry waste；DPW)，经检查去除去属、塑胶与杂物，再依乾物量调配成金鸡粪70％、玉米粉25％及糖蜜5％，并且调整水份40％，混合後置於青贮窖压紧密封，进行厌气粕酵。21日後取出晒乾，并作一般分析及热能测定；一般分析依A.O.A.C.(1984)法分析，热能测定以氧弹卡计(oxygen bomb carolimeter)测定，作为调配日粮之参考(表1)。

表1. 粕酵鸡粪之成分分析

        (2)完全日粮之制作：

        试验日粮参考NRC(1981)山羊的营养标准调配，日粮分为四组处理，依配方分别添加粉碎粕酵鸡粪0、15、30及45％(表2)，充分混合後挤压制成粒状完全日粮供试验用。试验日粮以胺基酸分析仪(Beckmen 6300 System)分析17种胺基酸供人工瘤胃(in vitro)试验之参考，完全日粮之胺基酸组成及成分分析分别列於表3及表4。

表2. 试验用饲料配方

表3. 试验日粮胺基酸组成^a

表4. 试验日粮成分分析值^a

        (3)试验设计及设备：

        利用连续性粕酵器(operation of continuous culture system)进行试验，试验设计为四个处理六重复。

        Ⅱ、试验方法

       (1)连续性粕酵器试验进行方法：

        1. 缓冲液配制：仿造人工唾液配制含矿物质等缓冲溶液(buffer)，其成分如表5。

表5. 人工瘤胃液缓冲液成分

        2. 瘤胃液采集：消化试验结束的羊只，每组取一头，继续任食相同日粮，经过四小时绝食後牺牲，迅速剥腹取出瘤胃，小心剥开瘤胃将内容物(digesta)倒出，用四层砂布挤压过滤，取含有微生物的滤液400~500ml置於塑胶瓶内，放入保温箱中迅速送实验室依组别置於粕酵器中培养。

        3. 培养期：将装置完成的连续性粕酵器运转後，经检视下列条件均符合後开始试验。前7日为调整期，後每隔3日为采样期，中间隔两天为调整期。反覆六次采样期间随时记录下列资料供尔後参考。

        (1)pH：用pH自动控制器(Chemcadet pH meter／controller)设定pH在6.0±0.5。以3N HCl及5N NaOH自动调整酸硷，每日记录酸硷使用量。

        (2)温度：利用恒温热水循环保温，使每个粕酵槽保持39.0±0.5℃，每两日检视恒温槽，防止缺水现象。

        (3)氮气：装设气压计，调整氮气压力为20mmHg。

        (4)自动给饲系统：每组粕酵槽每天给予80g粒状日粮，分别於上午和下午八时换装饲料，每管饲料装有40g(10g×4)，中间有塑胶分隔。再以马达减速器将饲料推入培养槽中。使各组皆能定时定量将饲料置入粕酵槽，供微生物利用。

        (5)缓冲溶液流量调整：每分钟流量换算公式如下：ml／分＝粕酵槽容积ml×24hrs×8％÷24hrs÷60分本试验F₁容器为1214ml，依上列公式故每分钟流量为1.62ml调整时每4分钟为6.5ml。

        (6)样品总流出量(over flow)：调整期每日上午8：00收集、秤重、记录并作为调整缓冲液之参考。

        (7)搅拌：自动搅拌防止饲料沈淀。

        4. 采样期(sampling period)：

        (1)冷却水：在采样前24hrs，将循环冷却水放入收集槽，开动冷却器(cooler)使水温保持在4~5℃。

        (2)每期连续三天为一个采样期：每天将流出样品秤重，用2000rpm均质机(Golygron, PT 10-35)均质5分钟，取样600ml／日置於4℃冰箱冷藏之，三天共采样1800ml。

        (3)将每期收集样品均质5分钟後取样200ml，用四层砂布过滤，取3×5ml置－20℃冷冻供氨态氮(NH₃-N)测定用，及3×25ml以5份样品加1份25％偏磷酸(H₃PO₄)充分混合後冷冻保存，供总VFA及个别VFA分析用。

        (4)将剩馀样品取2×500ml置於85℃烘乾箱(oven)烘乾，精确记录乾物质量，再将烘乾物粉碎贮存胺基酸及一般分析用。

        (5)每期取500ml缓冲液以85℃烘乾，供测定乾物质用。

       (2)测定项目及方法：

        1. pH之测定：每一采样期最後一天所采样品。立刻以酸硷测定器(Suntex SP~32型)测定。

        2. 氨态氮测定：依据A.O.A.C.(1984)之方法测定。

        3. 总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid)之测定：依森本宏(1971)方法测定。

        4. 个别挥发性脂肪酸(individual VFA)之测定：依据Erwin(1961)方法测定，以5000r.p.m 10℃远心分离20分钟(Hitachi SCR 20B)。取上层澄清液2μl注入气相色层分析仪(Varian 3400 gas chromatography)分析。再与标准液(Spelco WSFA-2)所析出尖峰面积比较换算摩尔百分比(molar％)

        5. 胺基酸分析：采用胺基酸分析仪(Beckman 6300 system)分析。取乾燥粉碎之样品0.07g，加适量内标准液(internal standard)正白胺酸(L-Norleucine)，添加6NHCl在110℃无氧下水解24小时。以5B定量滤纸过滤，取滤液加缓冲液(柠檬酸钠)稀释，过滤後取50μl注入胺基酸分析仪测定，以积分仪(Hewletl-packard 3390 A)测出某胺基酸的n mole数再换算成胺基酸百分比。

        Ⅲ、试验资料之统计分析

        (1)统计模式：

        采用完全逢机设计，In vitro之重复均假设符合下列统计模式：

        Y_ij＝μ＋T_i＋E_ij

        其中Y_ij．第i个处理的第j个观测值。

        μ：所有试验单位的平均值。

        T_i：第i个处理的固定效应，且∑T_i＝0。

        而E_ij：机差。

        (2)分析方法：

        利用SAS套装程式(Statistical Analysis System；简称SAS)做统计分析，并使用一般线性模式程序(General Linear Model Procedure；简称GLM)进行变方分析及利用邓肯氏(Duncan's Multiple Range Test)多变域性比较其差异性。

结果与讨论

        Ⅰ、对In vitro的瘤胃液性状之影响

        (1)对pH的影响：

        人工培养瘤胃液pH值经检测结果四组间皆无统计上的差异(P＞0.05)(表6)。此结果与Caswell et al., (1975、1977、1978)，Cullison et al., (1976)，Harmon et al., (1974)及Lucase et al., (1975)等之试验结果一致。本试验所订pH值为6.0±0.5，因此pH均在正常范围内。

        (2)对氨态氮(NH₃-N)之影响：氨态氮之浓度EDPW 30及45％添加组显着高於0及15％添加组(P＜0.05)(表6)。此结果与Caswell et al., (1975、1977、1978)，Goering and Smith(1979)及Lucase et al., (1979)等之研究结果相同。但添加15％组与对照组无显着差异(P＞0.05)，此与Harmon et al., (1974)研究指出不同热处理之DPW对瘤胃氨态氮亦无显着影响之结果相似。本试验可证明添加EDPW可使瘤胃液升高氨态氮之含量，而添加量超过30％以上则有显着差异。上述结果与Bhattacharya and Taylor(1975)指出鸡粪中含有高量非蛋白态氮(47~64％)其中尿酸态氮占总氮的30~60％，进入瘤胃後迅速被分解成氨有关。

        (3)总VFA的影响：

        如表6所示，总VFA之产生，对照组为139.35m mole／l显着高於其他三组(P＜0.05)，且添加EDPW量高者总VFA浓度有下降趋势。此结果与Cu1lison et al.(1976)研究添加乾燥肉鸡垫料(Brolier litter；简称BL)13~20％与大豆粕比较时，大豆粕组之总VFA产量显着高於添加肉鸡垫料组之结果完全一致。添加EDPW 15、30、45％三组在统计上无显着差异(P＞0.05)与Cullison et al.(1976)试验添加13~20％肉鸡垫料，各组间总VFA无显着差异之结果相似。也与Caswell et al.(1977、1978)Harmon et al.(1978)及Oltjen and Dinius(1976)研究乾燥鸡粪(dry poultry waste；简称DPW)或青贮BL对瘤胃液总VFA浓度均无显着差异之结果相同。但亦有相反之结果者如Cullison et al.(1973、1976)及Smith and Calvert(1976)添加DPW13~14％取代全量粗蛋白质，总VFA的浓度显着高於大豆粕组。综合以上研究报告结果，瘤胃液总VFA浓度之变异很大，各试验所得结果不一致之原因与饲料组成有关(Church, 1979)。

        本试验中对照组总VFA浓度显着高於各组之原因，与日粮含有高量碳水化合物(玉米)有关，因此添加EDPW愈高者，总VFA之浓度愈低与Church(1979)的报告一致。

表6. 日粮添加粕酵鸡粪对In Vitro的瘤胃性状之影响

        (4)对个别VFA摩尔百分比(molar％)之影响：

        1. 乙酸(C₂)之molar％影响：

        添加不同量之EDPW对C₂ molar％之影响，以添加45％组显着高於15％组(P＜0.05)，其他各组间均未达显着水准(P＞0.05)(表6)。Cullison et al.(1976)及Smith and Calvert (1976)等学者研究添加高量DPW时C₂的molar％显着高於低量组，与本试验之结果相同。

        2. 丙酸(C₃)之molar％影响：

        添加EDPW 0与15％组间无显着差异(P＞0.05)，但较添加30及45％组呈显着升高(P＜0.05)，且30％添加组亦显着高於45％添加组(P＜0.05)(表6)。Cross and Jenny(1976)设计等蛋白质日粮分别添加0、15、30、45％青贮火鸡垫料(ensiled turkey litter；简称ETL)取代青贮玉米秆，添加ETL者丙酸molar％较对照组呈现较低之值。本试验与上述结果相反，经查系因本试验添加EDPW取代玉米、大豆粕，因此降低日粮中的总能量及提高纤维含量，而Cross and Jenny(1976)的试验系以ETL取代青贮玉米秆，因为处理不同，致结果相异。Smith and Calvert(1976)以绵羊为试验，於日粮中添加7~14％乾燥肉鸡垫料(dry brolier litter；简称DBL)，对丙酸的molar％无显着影响，与本试验添加15％EDPW组与对照组无显着影响之结果相同。Church(1979)指出，日粮中总能含量高者C₃ molar％高，添加高量EDPW时粗纤维含量升高，总能降低，因此C₃ molar％有降低趋势，亦能合理解释此现象。

        3. 丁酸(C₄)molar％之影响：

        添加30及45％EDPW两组间对丁酸(C₄)的molar％无显着差异(P＞0.05)，但显着高於0及15％添加组(P＜0.05)(表6)。对照组与15％组也无显着影响(P＞0.05)，此与Smith and Calvert(1976)研究在日粮中添加7~14％之DPW与对照组的C₄无显着影响之结果相同。亦与Lucase et al.(1975)报告在日粮中添加20％乾燥牛粪，无显着影响之结果相似。Cross and Jenny(1976)指出添加15、30、45％ETL取代青贮玉米秆时，对照组之C₄ molar％显着高於15及45％ETL组(P＜0.05)，而本试验结果相异之原因为本试验以EDPW取代玉米、大豆粕，因此所得结果有差别，本试验证实添加30％以上EDPW会显着升高C₄ molar％，但添加15％者稍低之原因尚待进一步研究。

        4. 对异丁酸(iso-C₄)molar％之影响：

        不同EDPW添加量对iso-C₄的molar％的影响方面，0、15、30％三组间无统计上之差异(P＞0.05)(表6)。此结果显示添加15及30％EDPW不会影响iso-C₄的molar％，此结果与Caswell et al.(1975、1977、1978)，Harmon et al.(1974)，Oltjen and Dinius(1976)及Smith and Calvert(1976)等研究添加DPW或EDPW 7~22.8％时对iso-C₄无显着影响之结果一致。也与Lucase et al.(1975)研究日粮中给予20％乾燥牛排泄物不影响iso-C₄的molar％之报告一致。但与Cullison et al.(1976)试验添加BL 13％者显着较大豆粕降低iso-C₄的molar％之结果相异。本试验添加30％、45％EDPW两组间无显着差异(P＞0.05)，但添加EDPW 30％以上，则iso-C₄有增高的倾向，且添加EDPW 45％组显着较0、15％添加组为高(P＜0.05)。

        5. 对戊酸(C₅)molar％的影响：

        试验结果显示EDPW 15％添加组的C₅ molar％显着较对照组者为高(P＜0.05)。添加EDPW 15、30、45％三组间无显着差异(P＞0.05)(表6)。Caswell et al.(1975、1977、1978)，Harmon et al.(1974)、Lucase et al.(1975)及Smith and Calvert(1976)分别用不同处理的乾燥鸡粪或乾燥牛粪使用量在7~22.8％时，其C₅的molar％都无显着差异，与本试验添加EDPW 15~45％间亦无显着影响之结果一致。本试验结果与Cullison et al.(1976)用13％DPW与对照组添加大豆粕(SBM)比较C₅ molar％，对照组显着高於13％组的结果完全不同，其原因尚待探讨。总之，本试验添加EDPW组皆有较对照组为高的C₅ molar％之倾向。

        6. 对异戊酸(iso-C₅)的影响：

        试验结果显示添加EDPW与否，对iso-C₅皆无显着差异(P＜0.05)(表6)此结果与Caswell et al.(1975、1977)、Cullison et al.(1976)、Harmon et al.(1974)、Lucase et al.(1975)、Oltjen and Dinius(1976)、Smith and Calvert(1976)等研究添加5.8~32.8％的DPW、EDPW或DCW对iso-C₅ molar％皆无影响的结果相同。Caswell et al.(1978)以DPW取代50％的氮来源，其iso-C₅的molar％显着较对照组为高之结果与本试验结果相异。其原因不明。总之iso-C₅在个别VFA所占比例甚低。本试验结果表示添加不同含量之EDPW不会影响其molar％。

        7. 对乙酸／丙酸(C₂／C₃)比例的影响：

        低於30％添加组间C₂：C₃无统计上的差异(P＞0.05)(表6)。此结果与Cullison et al.(1973、1976)分别添加5.8~13％的BL时C₂与C₃之比较有显着差异，但添加13％者有升高之趋势的结果相似。也与Cross and Jenny(1976)以ETL添加0、15、30、45％取代青贮玉米秆无显着影响的结果相同。

        本试验中EDPW添加45％组，C₂／C₃比值显着高於各组，推测其原因有三：1. 日粮中含有高灰分。2. 粗纤维含量高。3. 较低的热能及较低的碳水化合物(Church, 1979)，因此C₃比例下降，C₂比例升高所致。

        Ⅱ、日粮中添加粕酵鸡粪进行In vitro时对粗蛋白质及胺基酸之影响

        (1)对粗蛋白质之影响：

        以瘤胃液In vitro培养後的粗蛋白质含量皆较原日粮为高，分别为：19.58、20.53、19.90及17.97％。EDPW添加45％组的粗蛋白质含量显着较各组为低(P＜0.05)。其馀各组间皆无显着差异(P＞0.05)(表7)。与原来日粮比较，对照组增加33.7％的粗蛋白质，15％组增加39.4％，30％组增加34.3％，45％组增加19.9％。显示45％组之微生物利用日粮中粗蛋白质及缓冲液(buffer)中之尿素合成菌体蛋白质(bacterial crude protein；简称BCP)的能力显着较其他三组为差。Stern and Hoover(1979)报告瘤胃BCP合成能力与日粮中碳水化合物及氮源有关。本试验45％组因含较低的碳水化合物及不同氮源(尿酸)，且乾物质及有机物表面消化率亦显着较差，因而其合成BCP的能力较差。

        (2)对总胺基酸之影响：

        总胺基酸的含量，对照组显着高於添加EDPW 45％组(P＜0.05)，而15与30％两组与各组间无显着差异(P＞0.05)(表7)。总胺基酸的产量，对照组增加8.6％，15％组增加15.7％，30％组增加27.3％，45％组增加1.9％。显示瘤胃微生物合成总胺基酸以45％组较差。而EDPW添加15及30％组，总胺基酸增加比例较对照组为高之原因有待探讨。

        (3)对於个别胺基酸的影响：

        天门冬胺酸(Asp.)、麸胺酸(Glu.)及白胺酸(Leu.)等胺基酸的量以45％显着较其他三组为低(P＜0.05)，其他各组间无显着差异(P＞0.05)(表7)。天门冬胺酸(Asp.)的量％皆较原来日粮为高，显示微生物合成Asp.能力颇高，30％添加组最高增加41.2％，45％增加14.5％最低，减少了17.2％，对照组亦减少8.1％。白胺酸(Leu.)以30％组增加46.1％最高，15％组增加41.8％次之，45％组增加2.3％最低。

        脯胺酸(Pro.)、缬胺酸(Val.)及苯丙胺酸(Phe.)等胺基酸，对照组与15％添加组高於45％添加组呈显着差异(P＜0.05)(表7)。脯胺酸(Pro.)的量四组间皆较原来日粮为少，从69.4％~96.6％。缬胺酸(Val.)的量则较原来日粮提高20.6~36.9％，以30％添加组增加最多，45％添加组最低。苯丙胺酸(Phe.)的量以50％组增加32.8％最多，45％添加组增加5.8最少。甲硫胺酸(Met.)及酥胺酸(Tyr.)对照组显着高於45％添加组(P＜0.05)，其他各组间无显着差异(P＞0.05)(表7)。甲硫胺酸(Met.)之增加量在52.2~105.3％间，其中以30％添加组增加最多，45％组最少。酥胺酸(Tyr.)各组之增加量在5.8~32.8％之间，仍以30％添加组增加最多，45％添加组最低。从以上个别胺基酸在量方面之消长，可知微生物合成胺基酸的比例以EDPW 45％添加组为最低。丝胺酸(Ser.)、甘胺酸(Gly.)、胱胺酸(Cys.)、异白胺酸(Ile.)、组胺酸(His.)、离胺酸(Lys.)、精胺酸(Arg.)、烃丁胺酸(Thr.)及丙胺酸(Ala.)等九种胺基酸，四组间皆无统计上之差异(P＞0.05)。

表7. 日粮中添加粕酵鸡粪对In Vitro粗蛋白质及胺基酸之影响

志谢

        本试验承蒙恒春分所苏安国先生慨借仪器并予指导仪器操作，及杨深玄先生协助试验之进行，特此致谢。

        参考文献从略。

饲料营养杂志(p.84～97)─陈坤照.詹德芳、九四年第一期