鸡卵黄中卵磷脂的分离与纯化
摘要
本航鸡蛋卵黄反覆以丙酮沉淀及乙醇、石油乙醚溶解，萃得约4.30％粗卵磷脂，萃制率不因原料蛋为生鲜、冷冻，水煮或盐渍等来源而受影响，然以正已烷萃得之卵黄油则未能分离出粗卵磷脂。粗卵磷脂进一步藉三氧化二铝管柱(4cm×87cm)层析，以氯仿：甲醇(9：1)为溶洗液，於溶出容量325~622ml份化，集得层析份化收率约占总份化45％、总份化收率1.99％的纯化卵磷脂；经TLC鉴定得悉试样之同质性甚高，以GC测定知其脂肪酸组成以14：0、16：0及18个碳以上脂肪酸为主，分别占总脂肪酸的2.71、32.62及51.27％，组成分类似标准品者；试样之红外线光谱图与标准品相似，其成分并由碳基(-CO-，1,715cm-1)及胺基(-NH2，1,640cm-1)的呈现而得以确认。
绪言
近年来，台湾地区鸡蛋在产销失衡情况下，价格时现低迷；此外，供制蛋糕原料蛋所馀卵黄之附加价值一向有待提高；凡此，在在显示蛋品加工利用迫切需要开发。卵黄含脂质28~36％，是仅次於水分的成分；卵黄脂质中甘油化合物62.5％、磷脂质32.8％、固醇4.9％，并有微量醣脂质(林，1983)；磷脂质是一种天然可食用、可消化的界面活性剂，广被应用於人造乳酪、巧克力、蛋黄酱、霜饰乃至药品、化妆品等(Windholz, 1983)。又由於卵磷脂含多种不饱和脂肪酸，在动物体内卵磷脂与胆固醇在鶣作用下，不饱和脂肪酸转移到胆固醇较易溶解，而易於经血液循环转移到肝脏，形成胆酸、胆汁而排泄(Lehninger，1982)，遂被认卵磷脂可能具有降低血液中胆固醇，而对高血压、血管疾病、动脉硬化、血栓、心脏病等具预防功用；是以近年来被视为"天然健康食品"，而竞相开发自卵黄分离卵磷脂之方法(平尾，1981；长谷川，1984；Singleton et al., 1964)。
卵磷脂(phosphatidylcholine)，是一种硬脂酸、棕榈酸及油酸等的双酸甘油酯化合物，藉磷酸基与胆硷结合成酯类(Windholz, 1983)。根据分子结构及官能基荷电特性，诸多有机溶媒及管柱层析材质被尝试用以分离及纯化卵磷脂；平尾(1981)利用高温熬炼，经过滤去除杂质并以淀粉赋形，平均每个鸡蛋卵黄炼得约4.5g的磷脂；长谷川(1984)则藉有机溶媒萃得磷脂含量约70％的卵黄油；Singleton et al., (1964)利用三氧化二铝(alumina)及矽酸(silic acid)为吸附剂(adsorbent)行管柱层析，进一步纯化卵磷脂。本试验旨在组合前人的方法，验证其应用价值。
材料与方法
Ⅰ、材料
(1)卵黄：以畜试所畜牧场所饲来航鸡之生鲜鸡蛋，经卵白，黄分离後供试。
(2)化学试剂：丙酮、正已烷─林纯，日本；乙醇─公卖局，台湾；石油醚、三氧化二铝、氯仿、甲醇、二乙基醚、碘、Ninhydrin、Dragendorff、二乙基碳酸盐、矽胶、溴化钾合成光学晶体─Merck，德国；卵磷脂(萃自生鲜鸡蛋卵黄)─Sigma，美国；金属钠─Riedel~De Haen AG，德国。
Ⅱ、方法
(1)鸡蛋一般化学组成分析：依A.O.A.C.(1990)方法。
(2)粗卵磷脂萃制：分别以生鲜卵黄、卵黄油、冷冻卵黄、煮熟卵黄及咸卵黄等原料，修饰Singleton et al.(1965)之方法，反覆利用丙酮沉淀，乙醇及石油醚萃取，经减压回旋浓缩後冷藏备用。
(3)粗卵磷脂之三氧化二铝管柱层析(Singleton, 1965，Haftmann, 1975)：
管柱制备 4cm×87cm长，管底由─玻璃棉薄层支撑。
↓
胶泥制备 以三氧化二铝：氯仿＝1：1(W／V)调和成泥状。
↓
装 填 胶泥装填至约50cm高後以氯仿流洗。
↓
粗卵磷脂吸着溶洗定量收集 藉氯仿将试样溶入并吸着於胶粒表面溶洗液，氯仿：甲醇＝9：1(V／V)°
(4)卵磷脂之脂肪酸测定：
1. 仪器：Hitachi Model 663~50GC(日本)；以FID为检测器。
2. 管柱：OV-11，3m长、3mm内径。
3. 带动气体：He。
4. 温度：注入口225℃；升温条件，60℃保持2分钟，继之以4℃／min速度升至120℃并保持1分钟，然後以5℃／min速度升至220℃保持300分钟。
5. 试样前处理：依Glass et al.(1965)之方法，将试样之脂肪酸乙酯化後取5μl注入GC。
(5)三氧化二铝管柱层析各份化之薄层分析(Singleton, 1965)：取溶於氯仿之试验溶液5μl，点注於矽胶板上，分别经氯仿：甲醇：水＝325：125：20(V／V／V)及石油醚：二乙基醚＝450：50(V／V)展开各3小时，然後以1％之碘，宁海特林(Ninydrin)及突拉根道夫(Dragendorff)液染色。
(6)红外线光谱分析：藉红外线光谱仪(IR 260-50；Hitachi，日本)测定；取乾燥试样0.5mg加入200mg溴化钾，研磨後以500Kg／cm2压力打片後行IR扫瞄。
结果与讨论
Ⅰ、鸡蛋之一般化学组成
表1显示，来航鸡蛋卵黄、白之固形物分别约为48及11％，与林(1983)所载无甚差异，其中卵黄之粗脂肪含量29.0％，占全蛋脂肪之99.5％，如拟利用蛋中脂质成分，卵白几可忽略。
表1. 鸡蛋之一般化学组成分
| Samples | Moisture | Crude protein | Crude fat | Ash |
| ％ | ||||
| Yolk White |
49.81±1.16 88.38±0.87 |
16.64±0.66 10.06±0.83 |
29.06±2.20 0.12±0.02 |
1.77±0.11 0.64±0.12 |
Ⅱ、卵黄中粗卵磷脂之萃制
在卵黄约30％脂质中，62.3％为三酸甘油酯，32.8％磷脂质及4.9％固醇类，而磷脂质又分别由卵磷脂(70％)、脑磷脂(25％)及神经磷脂(2.3％)所组成(林，1983)，是以理论上卵磷脂约占生鲜卵黄的6.8％，为丰富的卵磷脂来源。表2显示，自不同处理方式的鸡卵黄萃出粗卵磷脂收率，虽以水煮卵黄的4.55％最高，但生鲜、冷冻、咸卵黄各组亦在4.11％以上，可见这四种原料处理对粗卵磷脂萃出率影响不大；然而，未能自卵黄油萃得粗卵磷脂，显示卵黄油萃取用的正已烷并未将卵磷脂同时溶出；由於卵磷脂仅微溶於苯(Windholz, 1983)，而正已烷非极性与苯相近(Lehniger, 1982)，所以卵磷脂未能随卵黄油萃出。
表2. 鸡卵黄处理方式对粗卵磷脂萃出率的影响
| Treatments | Wt of crude phosphatide(g) | Yield of crude phosphatide(％)* |
| Fresh Yolk oil Lyophilized Cooked Salted |
22.37±3.25 none 21.50±4.93 22.82±3.07 20.93±5.47 |
4.46±0.64 none 4.30±0.56 4.55±0.89 4.11±0.98 |
| *Yied％＝(wt of crude phosphatide／wt
of raw yolk)×100 **Applied sample：500 g／batch |
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Ⅲ、粗卵磷脂之三氧化二铝管柱层析
卵磷脂分子上之烷基、磷酸基及胆硷是决定其化学功能性因子(Windholz, 1983)，而磷酸基与胆硷的存现，可能使卵磷脂易吸附於三氧化二铝(Heftmann, 1975)。粗卵磷脂於三氧化二铝管柱层析份化(表3)，依溶出液色泽及清浊度，计收集11个份化，每一份化配合薄层分析做成分初步鉴定，得悉由第2至11份化均有卵磷脂被溶洗出来，其中2、3、4三个份化显着较具同质性(homogeneous)，且染色时呈Dragendorff阳性，其层析份化收率(chromatographed fraction yield)合计45％，总份化收率(overall yield of fraction)为1.99％。此纯化卵磷脂外观呈淡黄色，一如Windholz(1983)所述。第5至11份化仍含有卵磷脂，但非同质性(non-homogeneous)增加，可能另含中性脂质、Lysophosphatide及其他磷脂质成分。
表3. 鸡蛋粗卵磷脂之三氧化二铝管柱份化
| Fraction | Fraction volume(ml) | Appearance | Fraction wt(g) | Chromatographedc fraction yield(％) | Overalld yield of fraction(％) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
324±57 270±40 14±1 14±1 14±2 361±28 33±4 132±3 18±2 133±19 198±16 |
clear, colorless hazy, yellowish cloudy,yellowish hazy,yellowish clear,colorless clear,colorless cloudy,yellowish hazy,yellowish cloudy,yellowish hazy,yellowish cloudy,yellowish |
0.38 4.08 4.01 3.04 5.39 1.92 1.99 0.38 0.21 0.91 0.91 |
1.52 16.32 16.04 12.16 21.56 7.68 7.96 1.52 0.84 3.46 3.46 |
0.07 0.73 0.72 0.54 0.96 0.34 0.35 0.07 0.04 0.16 0.16 |
| a. Conditions：column size 4cm×87cm,
eluent chloroform：methanol 19：1, applied sample 25g／batch b. Data in the table represent means of 3 replicates. c. Yield based on wt of crude phosphatidesapplied to column. d. Yield based on starting wt of yolk. |
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Ⅳ、卵磷脂之脂肪酸组成
同脂性卵磷脂藉GC测定其脂肪酸，试样卵磷脂与标准品之气相色层分析图相似，然18C以上脂肪酸(主要为硬脂酸、油酸及亚麻仁油酸)(Singleton et al., 1965)则未能成功分离。将各波峰经积分仪计算其分布比例，得悉粗卵磷脂与纯化卵磷脂脂肪酸组成特性不同(表4)，就量而言，粗卵磷脂以14：0(1.96)16：0(23.85％)、16：1(3.98％)及18C以上的54.38％为主；纯化卵磷脂，无论试样或标准品，则以14：0、16：0及18C以上三类脂肪酸为主，其中16：0与18C以上合计更达81~83％，且两者组成比例相似；此一结果与Singleton et al., (1965)所获鸡蛋卵磷脂脂肪酸之16：0与、37.7％、18C以上59.1％，亦甚接近，然与大豆卵磷脂(Windholz, 1983)之16：0、11.7％、16：1、8.6％及18C以上78％，则有显着差异。
表4. 鸡卵黄油、粗卵磷脂及纯化卵磷脂之主要脂肪酸组成
| Samples | 4：0 | 6：0 | 8：0 | 10：0 | 12：0 | 14：0 | 16：0 | 16：1 | 18：0,1,2 |
| ％ | |||||||||
| Yolk oil
Crude lecithin Purified lecithin Authentic lecithin |
0.10 ±0.04 0.11 ±0.01 0.13 ±0.04 0.62 ±0.11 |
0.35 ±0.21 0.81 ±0.15 0.44 ±0.14 2.06 ±0.62 |
0.12 ±0.09 0.36 ±0.16 0.12 ±0.02 0.85 ±0.14 |
0.11 ±0.07 0.02 ±0.01 0.23 ±0.06 0.09 ±0.03 |
0.03 ±0.20 0.34 ±0.02 0.12 ±0.01 0.28 ±0.07 |
0.75 ±0.20 1.96 ±0.69 2.71 ±0.38 1.93 ±0.51 |
30.12 ±1.33 23.85 ±0.23 32.62 ±0.23 31.86 ±0.36 |
0.24 ±0.11 3.98 ±3.32 0.40 ±0.07 0.97 ±0.10 |
65.75 ±3.23 54.38 ±8.23 51.27 ±2.05 50.98 ±2.45 |
Ⅴ、卵磷脂之IR光谱鉴定
第2、3、4份化卵磷脂之IR图谱，大致同於标准品者，其中碳基(-CO-, 1715cm-1)及胺基(-NH2, 1640cm-1)的存现(Nakanishi, 1976, Silverstein, 1977)，更是确认卵磷脂重要佐证，盖此两官能基毗邻而现，正意味试样中含有胆硷(Windholz 1983)。
综上所述，藉丙酮沉淀，乙醇、石油醚溶解，约可自鸡卵黄萃得4.3％粗卵磷脂，粗卵磷脂经三氧化二铝管柱氯仿：甲醇(9：1)溶洗液层析，可纯化出高同质性卵磷脂约2％，纯化效率值得定；如拟工业化应用，应予回收有机溶媒方合乎经济效益。
志谢
试验承台湾省畜产试验所加工系林月娥，蔡丽卿两位小姐协助，谨此申请。
参考文献从略。
饲料营养杂志(p.81～89)─王政腾.梁逸、九四年第二期