饲粮代谢能含量对白罗曼鹅肝脏

脂质合成相关酵素活性之影响

摘要

        本试验旨在探讨饲粮代谢能含量对白罗曼肝脏脂质合成相关酵素活性之影响，试 鹅只系采用台湾省畜产试验所彰化种畜繁殖场所育成之白罗曼鹅，进行0~3与4~6周龄(试验1)及7~9与10~12周龄(试验2)之试验。试验1系选取1日龄之雏鹅，试验2则以7周龄之生鹅，逢机分配至五个不同饲粮代谢能含量处理组，其代谢能含量均分别为2500、2700、2900、3100及3300 kcal／kg，粗蛋白质含量分别为20％(试验1)与15％(试验2)。两个试验，每处理组均为二重复，每重复12只，公母各半。试验期间采平饲，饲料与水均采任食。

        试验全期之肝脏ATP-柠檬酸分解鶣(ATP-citrate cleavage enzyme, EC 4.1.3.8；CCE)各处理组间皆无显着之差异，3与6周龄肝脏之NADP-苹果酸去氢鶣(NADP-malic dehydrogenase, EC 1.1.1.40；MDH)，葡萄糖-6-磷酸去氢鶣(glucose-6-phosphate dehydrogenase, EC 1.1.1.49；G-6-PDH)与脂肪酸合成鶣(fatty acid synthetase；FAS)之活性，皆随着饲粮代谢能由2500 kcal／kg提高到3100 kcal／kg而上升，而当饲粮代谢能含量提升到3300 kcal／kg时又下降，12周龄肝脏之CCE、MDH、及G6PDH之活性均以2900 kcal／kg处理组较高，FAS则以3100 kcal／kg处理组显着地较高。

绪言

        动物体内几乎所有组织都具有脂质生成作用，但较重要之合成场所，包括肝脏、脂肪组织、小肠、骨骼及皮肤等，其中又以肝脏及脂肪组织的合成较多(Yeh and Leveille, 1973；Leveille et al., 1975；Nir and Lin, 1982；Leclercq, 1984)。哺乳动物中，如鼠(rat)、猪(swine)、绵羊(sheep)与母牛(cow)等，其脂质生成作用以脂肪组织最多，肝脏次之(Leveille, 1967；O'hea and Leveille, 1969a)。而在家禽脂质生成作用则以肝脏组织较脂肪组织为多(Goodrige and Ball, 1967；Evans, 1972；Yeh and Leveille, 1973)。O'hea and Leveille(1969b)之试验研究指出，鸡只脂肪酸的合成量的90~95％在肝脏。骨骼亦具有部分之合成能力(Nir and Lin, 1982)，而Goodridge and Ball(1967)则发现，鸽子体内脂肪酸的合成量之96％在肝脏。

        脂质生成作用系指利用非脂肪物质(Non-fat material)主要为碳水化合物及生醣性胺基酸(Glycogenic amino acid)合成脂肪酸之过程(Tanada, 1982)。而影响家禽肝脏脂质合成相关酵素活性之饲料营养因素包括；饲粮代谢能含量(Tanaka et al., 1982b；1983b)，饲粮油脂(Tanaka；1983b)，饲粮碳水化合物含量与来源(Tanaka et al., 1983a；Hsu et al., 1987b)，饲粮蛋白质(Yeh and Leveille, 1972)，饲粮纤维(Akiba and Matsumoto, 1980)及维生素与矿物质(Bannister et al., 1983；Pearce et al., 1983)等因素。但在上述之影响因子中，能量与蛋白质原料占家禽饲粮组成的90％以上，饲粮能量不仅是影响蛋白质利用的重要因子(Summers et al., 1964)，亦为左右家禽肝脏脂质含成的重要因素(Tanaka et al., 1982a,b)，因此；本试验将从营养观点经生理途径来探讨饲粮代谢能含量对白罗曼鹅肝脏脂质合成相关酵素活性之影响。

材料与方法

        Ⅰ、试验材料

        采用台湾省畜产试验所彰化种畜繁殖场所育成之白罗曼鹅，进行0~3与4~6周龄(试验1)及7~9与10~12周龄(试验2)之试验。试验鹅只於1日龄时经公母鉴别，并挂上识别翼号後，依公母性别逢机分配於五个日粮处理组，二个试验，每处理均为二重复，每重复12只，公母各半，共计使用雏鹅240只。

        Ⅱ、试验设计与饲养管理

        本试验采完全逢机设计(completely randomized design；CRD)，於试验1，选取1日龄鹅逢机分配至五个不同代谢能处理组，其代谢能含量分别为2500、2700、2900、3100及3300kcal／kg，五个处理组之粗蛋白质含量均为20％。试验2之试验鹅只於0~6周龄，饲与含粗蛋白质20％，代谢能2900 kcal／kg之生长期饲粮，於第7周时，选取体重相近之鹅只，逢机分配到五个不同代谢能处理组，分别为2500、2700、2900、3100及3300 kcal／kg，各处理组之粗蛋白质含量皆为15％。试验饲粮组成如表1、表2所示。试验鹅只经保温二周後废温，4周龄时注射家禽霍乱疫苗，试验期间采平饲，饲料与水均采任食。

表1. 试验饲粮组成(试验1)

* Supplied per kilogram of diet：

   Vit. A, 10000 IU=;Vit. D, 1500 IU=;Vit.E, 10 mg ; Vit.B₁, 2 mg ; Vit B₂, 5 mg ; Vit B₆, 3 mg  ; Vit B₁₂, 5μm ; Vit K₃, 3 mg ; Folic acid, 1 mg ; Pantothenic acid, 15 mg ; Nicotinic acid, 50 mg ; Mn, 80 mg ; Zn, 46 mg ;Fe, 30 mg ; Cu, 10 mg ; I, 1 mg ; Se, 0.15 mg. 

表2. 试验饲粮组成(试验2)

* Supplied per kilogram of diet：

   Vit. A, 10000 IU=;Vit. D, 2000 IU=;Vit.E, 12.5 mg ; Vit.B₁, 2 mg ; Vit B₂, 6 mg ; Vit B₆, 4 mg  ; Vit B₁₂, 5μm ; Vit K,4 mg ; Folic acid, 1 mg ; Pantothenic acid, 12 mg ; Nicotinic acid, 40 mg ; Mn, 65 mg ; Zn, 46 mg ;Fe, 30 mg ; Cu, 4 mg ; I, 0.3 mg ; Se, 0.15 mg. 

        Ⅲ、测定项目及方法

        (1)试验之采取

        试验1於试验之第3、6周，试验2在第9、12周龄时，自每处理组中逢机选取公母各4只，即每处理组8只，切断颈动脉放血之後，立即取出肝脏置於4℃之冰冷生理盐水(0.9％ Nacl)浸洗，再以滤纸吸乾，然後称重并记录之。随即切取肝脏右叶组织4克，置於装有1mMEDTA-Na、0.25M sucrose 36ml之冰冷溶液的均质试管中，先以剪刀细切後，使用均质机在一面冷却一面均质的情况下，均质一分钟。均质液以冷冻离心机在4℃，10849 rpm(10,000Xg)远心分离10分钟，使细胞核与粒线体沉淀，取上清液再经超高速冷冻远心分离机(Beckman XL-90Ultracentrifuge)於4℃、30,000 rpm(105,000Xg)远心分离60分钟，使肝细胞之微粒体(microsome)沉淀，上清液为细胞质液，供测定脂肪酸合成相关酵素活性与蛋白质含量。

        (2)肝脏脂肪酸合成相关酵素活性之测定

        1. ATP-柠檬酸分解鶣(ATP-citrate cleavage enzyme；EC 4.1.3.8；CCE)依Takeda et al.,(1963)之方法，经部分修订後测定之。

        2. NADP-苹果酸去氢鶣(NADP-malate dehydrogenase；EC 1.1.1.40；MDH)依据Ochoa et al., (1955)之法，经部分修正後测定之。

        3. 葡萄糖-6-磷酸去氢鶣(Glucose-6-phosphate dehydrogenase；EC 1.1.1.49；G6PDH)依据Lohr and Waller(1974)之方法，经部分修正後测定之。

        4. 脂肪酸含成鶣(Fatty acid synthetase；FAS)依据Kumar et al.(1970)之方法，经部分修後测定。

        5. 肝脏酵素液蛋白质浓度之测定

        依据Lowry et al.(1951)之改良方法，测定肝脏酵素液之蛋白质浓度，以计算酵素之比活性。

        6. 酵素比活性之计算

        ATP-柠檬酸分解鶣，NADP-苹果酸去氢鶣、葡萄糖-6-磷酸去氢鶣及脂肪酸合成鶣之比活性计算，依据示波纸上所记录之吸光值(OD值)、反应时间及肝脏酵素液之蛋白质浓度再由下列公式计算。

        公式：酵素比活性(n mole／min． mg protein)

                    ＝〔V／(E×d×CP×v)〕×(△e／△t)

        V：酵素反应液之总容积(ml)

        v：肝脏酵素测定液之量(ml)

        CP：肝脏酵素液之蛋白质浓度(mg protein／ml)

        d：光路径    d＝1cm

        E：分子吸光系数(6.2 ml／μ mole．cm)

        △e／△t＝单位时间内酵素反应液之吸光值变化。

       Ⅳ、统计分析

        试验所得资料，利用统计分析系统(SAS，1985)做统计分析，并使用一般线性模式(General Linear Model Procedure；GLM)进行变方分析，再以最小均方值(Least square means)估计并比较处理间平均值的差异显着性。

表3. 饲粮代谢能含量对三周龄白罗曼鹅肝脏脂质合成相关酵素活性之影响

ATP-CCE⁽¹⁾：ATP-citrate cleavage enzyme

NADP-MDH⁽²⁾：NADP-malate dehydrogenase

G6PDH⁽³⁾：Glucose-6-phosphate dehydrogenase

FAS⁽⁴⁾：Fatty acid synthetase

^a，b，c：Means within the same row with different superscripts differ(P＜0.05).

结果与讨论

        本试验所测定之酵素，包括ATP-柠檬酸分解鶣、NADP-苹果酸去氢鶣、葡萄糖-6-磷酸去氢鶣及脂肪酸合成鶣，兹就饲粮代谢能量对此四种酵素活性之影响加以探讨。由表3结果显示，於3周龄鹅只肝脏中CCE、MDH、G6PDH与FAS之活性均以3100 kcal／kg处理组最高，且MDH、G6PDH与FAS之活性均以3100 kcal／kg组显着较2500 kcal／kg组为高(P＜0.05)，6周龄时MDH之活性亦以2500 kcal／kg处理组显着较3100 kcal／kg处理组为低，CCE、G7PDH及G6PDH之活性各处理组间均无显着差异(表4)。9周龄时各处理组间虽无显着之差异，但四种酵素活性以2900 kcal／kg处理组较高(表5)，表6显示12周龄时肝脏之CCE、MDH及G6PDH之活性，均以2900 kcal／kg处理组显着较2500 kcal／kg处理组高，FAS之活性则以3100 kcal／kg处理组显着较高(P＜0.05)。综合3周龄与6周龄之肝脏中CCE、MDH、G6PDH与FAS之活性显示，此四种酵素活性随着饲粮代谢能由2500 kcal／kg提高到3100 kcal／kg而上升，但至3300 kcal／kg时则又下降，而9周龄与12周龄时则以2900 kcal／kg处理组最高。一般饲粮代谢能提高时，能量除供动物维持所需外，额外之能量则提供作脂肪的合成，故高能量饲粮会提高脂肪酸合成相关酵素活性。另一方面，固定饲粮中蛋白质含量，以碳水化合物调整饲粮代谢能时，肝脏脂肪酸合成相关酵素活性随饲粮代谢能之提高上升(Tanaka et al., 1982a；1983a)。而本试验中，各处理组蛋白质含量均为固定，故在调整饲粮代谢能时，在低能量情况下随着饲粮代谢能之提高，饲粮中碳水化合物含量随之增加，但在高能量处理组之饲粮，所增加之能量到来自脂肪，碳水化合物含量反而降低。Tanaka et al.(1983a)之研究显示，鸡只饲粮中碳水化合物含量增多时，会促进糖酵解作用，使pyruvate生成量增加，因此脂肪酸合成之基质亦增多，在pyruvate-循环所产生脂肪酸合成所需之还原物质NADPH之量亦提高，因而进一步提高脂肪酸合成相关酵素活性。本试验中，由於2900及3100 kcal／kg处理组之饲粮中由碳水化合物(玉米)所提供之能量较高，因此肝脏中CCE、MDH、G6PDH及FAS之活性亦有较高之趋势。另方面，Pearce(1971)指出0及5％玉米油的给饲不影响肝脏脂质生成与MDH及CCE之活性，Tanaka et al.(1982b，1983b)之试验显示，饲粮中大豆油含量在6％以上时，会提高血浆中游离脂肪酸之浓度，明显地降低MDH与CCE之活性，因此抑制脂肪酸合成相关酵素活性，故减少脂肪酸的合成。陈等(1994)进行饲粮代谢能量含量对白罗曼鹅生长性状与血液脂质成分之影响的试验结果显示，饲粮代谢能3300 kcal／kg处理组於0~6周龄与7~12周龄时饲粮中大豆油添加量分别为72％与5.5％，且些处理组之血浆中游离脂肪酸浓度较各组为高。Tanaka et al.(1981)报告指出，饲粮油脂含量提高後，血浆中游离脂肪酸浓度即显着提高，因此脂肪酸快速的被活化并与游离CoA结合成长链脂肪醯辅鶣A，减少了游离CoA浓度，使柠檬酸透过粒腺体膜至细胞质之速率及乙醯辅鶣A羧化鶣之活性下降，因而抑制脂肪酸合成相关酵素活性。

表4. 饲粮代谢能含量对六周龄白罗曼鹅肝脏脂质合成相关酵素活性之影响

^{(1)，(2)，(3)，(4)}：See Table 3.

^a，b，c：See Table 3.

表5. 饲粮代谢能含量对九周龄白罗曼鹅肝脏脂质合成相关酵素活性之影响

^{(1)，(2)，(3)，(4)}：See Table 3.

表6.饲粮代谢能含量对十二周龄白罗曼鹅肝脏脂质合成相关酵素活性之影响

^{(1)，(2)，(3)，(4)}：See Table 3.

^a，b：Means within the same row with different superscripts differ(P＜0.05).

        在鸡只方面之研究显示，肝脏中G6PDH之活性很低，且不受饲粮组成改变之影响(Hsu et al. 1987a)，但由本试验中发现，鹅只肝脏中G6PDH之活性较鸡只为高，且受饲粮改变之影响，此与Hsu et al. (1987b)以鸭所做之试验结果指出，鸭肝脏G6PDH之活性显着较鸡为高，且受饲料组成不同的影响之结果相似，由此显示，磷酸五碳醣回路去氢醣可能亦是提供水禽肝脏脂肪酸合成所需之还原当量的主要来源，此为水禽与陆禽在脂肪酸合成时不同之处。(畜产研究28(1)37~47, 1995)

饲料营养杂志(p.4～12)─陈添福、许振忠．九五年第十期

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