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中药天然低分子物质研究法
(三)沈淀法
铅盐法系粗浸膏之水或木精溶液加酢酸铅或盐基性酢酸铅之饱和溶液使其分为沈淀(有机酸类，鸆酸类，基他之苯酚性化合物，盐基性物质，蛋白质等)及不沈淀者之分离方法。从前用於比较大规模植物成分之分离。脱铅则使用硫化氢，但作成药理试验之检体时应留意铅离子及疏黄之混入，以离子交换树脂行脱铅操作较宜。
(四)以衍化体分离
收量容易而且易於回复原物质之衍化体，可将精制成分诱导予以分离，例如将脂肪酸及鷕，碳酸以酯蒸馏，或者以分取瓦斯色光度器分离，或将生物硷作成各种监类使其结晶，或者将具有酒精性或苯酚性基之成分以醋酸或Benzoate变化溶解度再结晶，或使用柱层析法最为平常。同时acyl衍化体中Azobeuzoate为有色物质，如将无色成分作成此型以column chromatograpby分离时较为方便。Ketone，乙醛aldehyde，之分离与carbonyl衍化体hydrozone由Girard试药而分离之分离法有效地曾应用於类固醇激素之精制。
最後的精制法有再结晶法及蒸馏法，上述方法系以早期狭义地天然化学研究对象之中低分子成分之分离法，惟具有生理活性之物质未必为分子量小之成分，自有高分子之物质存在，故须用生化学的方法中透析或分子筛法，无论如何经济的有效的分离并精制大量天然化合物之方法其未解决的问题仍多，而且有待今後之研究。
(五)分离精制过程中成分之分解
粗浸膏所具活性经分离结果在各分划活性降低或各分划的综合活性不能出现时，涉及分离过程中有效成分分解之可能性者较多。应就各分划以薄层层析法或滤纸层析法，瓦斯层析法与分解前试料行比较试验。在酒精中长时间加热时有酯及lactone类之alcoholysis，acetal，ketal分解及生成，以酸及硷处理时加水分解、转化racemic化等为周知之事实。纯物质迟度反应时在粗fraction中由於夹杂物的触媒发生作用而容易分解，亦为应留意者。相反的由於具有安定剂作用物质被去除，精制後则变成不安定。
最近Wenkert等证实由Rosmarinus spp.及Salvia spp.所分离之carnosol及rosmaricine(生物硷)均为抽出中由carnosic acid生成之二次的生成物。前者於抽出分离中受空气氧化，後者受空气氧化与分离中使用之氨之作用而生成。
香菇之香气亦为二次的生成物lenthionine所致，此系由前驱物质A所生，此事实由森田等证实，如此二次产物较为有用者有之，紫之有效成分亦属比例。泷泽证实红茶系以茶叶自己酵素氧化制成，此系Catechin类引起氧化的缩合而形成有色染料。
五、构造的决定
确认精制化合物构造前最重要者为判断此物质在植物化学成分的分类上属於何系统。此点须考虑左列各项。
(一)分离精制过程
对溶媒之溶解度，酸性苯酚性，盐基性之区别，挥发性及柱层析法之吸着性，以至薄层层析法之Rf值，瓦斯层析法时之保持时间等将提供重要提示已如前述。
(二)各种呈色反应
苯酚系化合物之FeCl3反应，diazo反应，生物硷之Dragendorff反应，类固醇triterpenoid之Liebermann反应，flavonoid之Mg－HCl反应等，此外紫外线照射下之有无萤光性为判定芳香族化合物基本构造时颇有用。
(三)紫外及可视部之光谱
炭水化物，脂肪酸，以及无共轭不饱和系之类固醇，terpenoid等虽不呈「最大吸收」但具有共轭不饱和系者及芳香族化合物均呈特异的吸收曲线。由此多可推定其基本构造，但有时须将acetate之衍化物OH，＞NH等效果减少始能观察分子构造本身之吸收。有关天然有机化合物全部之紫外，可视部光谱之参考书，Scott之着书颇具盛名。
(四)红外部吸收光谱
3000～2800Cm-1附近有强吸收者为脂肪族化合物，相反的此附近吸收相对的弱1600～1500Cm-1附近及1100Cm-1以下有多数强吸收者芳香族化合物之可能较大。3600～3300Cm-1附近及1100Cm-1附近有强幅吸收者为含有多数-OH之化合物，类似炭水化物，配糖体等之可能性较大。天然苯酚系化合物而具有每-OH行分子内氢结合之＞C＝O者－例如(对)苯鷅类，flavonoid及其他－多在1650～1610Cm-1附近呈强吸收。具氨基性结合的化合物(鶹)亦在此附近呈吸收。
(五)核磁共振光谱
脂肪族化合物於T8～9附近呈现复杂偶连(Coupling)信号(Signal)！尤其此附近出现之－C－CH3及H－C－CH3之信号数及连结之样式有助於类固醇mono，sesgui及triterpenoid之区别。相反的芳香族化合物於此附近之偶连少(通常除CH3及－CO－CH3外概不能发现)，并於T2～3附近呈现与芳香族proton对应之信号。核磁共振光谱以CHCl3，CCl4等溶液测定为宜，但具多数功能基之天然化合物难溶於此类溶剂，不得不用以重氢置换之Olimethyl sulfoxide Pyridive acetone。解析时应考虑溶媒效果为要。
(六)其他之物理化学的性状
融点，有无旋光度，Pka;mass spectrum (Mass-speclade)。
(七)Chemotaxonomy的观法：
植物成分中有含有糖类，sterol类，triterpenoid(α及β-amyrin.oleanolic acid,lupeol等)者。亦有如flavohoid广泛含於多种科属之植物及特异的出现於与形态分类具有密切关系之植物者最近考察此种学问之领域常用(hemotaxomomy术语)。属於後者有如自古则为众知之生物硷，冠以植物科属名呼之，茄科生物硷，防已科生物硷，豆科生物硷石蒜科生物硷鸟头科生物硷，黄杨科Buxaceal生物硷，楝科meliaceal生物硷，藜芦veratrum生物硷高卡生物硷。其他系统之化合物薯蓣科之类固醇系皂素，萝摩(Asclepiada ceae)科之pregnan系化合物，meliaceal科、芸香料，苦木科之苦味质(degradated triterpene)，五加科，人参属三鷕(Triterpene)配糖体、蕨类、三鷕类松科、杉科，萝汉松科等之二鷕(Diterpene)类，菊科之sesqui terpene及乙炔系化合物，柏科之sesgui terpene， 形花科之Coumariue、脂肪酸、Butylphthalate，豆科之Isoflavove，茜草科、蓼科之羟基葸鷅(Oxyanthraquinone)，地衣类之芳香羟酸酯，地衣内脂等有多数例最近已经证实其存在。
由以上述理由先调查研究对象植物之近绿者，含有何种成分已被分离，做为确认构造之参考，具有重要提示作用。同时一种植物中多混有构造类似之数个成分 ，因此先知悉由该植物已分离出何种化合物亦有必要。考察以上各点时，不只要注意其表面上之化学构造，亦要充分考虑植物中成分之生合成经路。例如鸦片中有多种生物硷共存，其中有发现化学构造上属於不同系统，但其生合成实有互相密切关连。由上述预备试验的考察，如能推定其化合物属於何系统时，分别按其系统化合物之特有研究方法进一步实行详细构造研究。
(八)分子式之决定
经原物质及其衍化物之元素分析，分子量测定结果决定分子式。分子量测定主以质量光谱，X线测定法或Osmometer测定法行之，此等方法比过去所用方法简便而且正确。核磁共振光谱亦能相当正确地表示分子中H数，故决定分子式颇有用。
(九)与既知化合物之鉴定
所得化合物是否属於文献上既知之天然化合物，其文献调查方法将作其他记述，虽未由天然物单离但以合成品或其他天然化合物之衍化体，分解产物出现者亦有可能性。此种情况之文献调查甚困难，时须进行构造研究，同时调查有关其系统之化合物之总说及参考书。
物质之鉴别普通实行混融，但复杂的天然化合物之立体异性体间往往不呈显着融点下降。而且多功能基之化合物亦有不呈明确融点者。现今并用红外线光谱，薄层层析法，质普光谱(新近有瓦斯层析法，与质谱仪法直结装置出售)或X线粉末法予以鉴别，不但应用於原物质之比较，衍化体间之鉴别时亦有必要。
光学的异性体间之鉴别不仅要求〔α〕p，最近常比较检讨施光散曲线。racemic体与光学活性体间，两者溶液之红外线光谱虽然一致，但固体之光谱不一致。
(十)未知成分之构造研究
对新物质行构造研究时可以分下列四种方法：
第一方法为检讨红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱、质普光谱等物理化学的成绩，各种衍化体之分析结果後决定功能性基种类、数量，进而由化学的变型将该物质与既知物质相互作用而决定构造，而接其系统化合物研究法之常轨决定置换基之位置及配位。光学的活性体(terpenoid steroid alkoloid等)其旋光分散曲线及丹二色性曲线之解析，对於推定C=O等之位置及其周边之立体构造有益。
第二方法为该系统之天然物既有多数化合物被发现而对该物质或其衍化体关连之化学的或物理化学的成绩整理，法则性已确立者，由於所得试料少量时，将该物质以符合前述法则而推定其构造。例如gibberellin群自A1开始有多数化合物被发现。此类物质之核磁共振光谱，质普光谱之一般的法则已确立，极微量之具有gibbane构造之新物质被发现时亦可决定其构造。此类化合物因对其植物生长之活性有助於推定具有gibbane构造。以特有生理活性作为未知物质基本构造之推定之重要关键有之。
第三方法为物质量少而由前述方法及合成的考察或chemotaxonomy的推察略能推定其构造时，不必将原物质再行化学的变型或分解，由既知物质半合成的衍化而决定其构造。此法需要高度有机化学的知识不待赘言。Helmintl osporum Sativum中之Sativene的构造，可能为同菌之代谢产物helminthosporin之生合成中间体，而且由红外光谱，核磁共振光谱推定时上列式最为妥当，Corey等由生合成的有关连之longifolene以巧妙的transanular之Hydride shift反应实施对掌体之半合成，进而决定立体构造。
第四方法为X线解析法。最近电子计算机进步，若能得到适当结晶，短期间内即可确定其构造。具有新构造之化合物，依照过去方法不易研究其构造时，现今则常以X线解析法研究，能节省试料、时间，而且亦不必行分解反应。解析时须要制造halogen及重金属衍化体之单结晶，因此须先检讨原物质之功能基性状。同时亦须明了用於解析之衍化体与原物质间化学的关系，上述各点之试验，现今以各种光谱物理化学的方法发挥高度力量而能达此目的。(译自「医药品研究法」田中治、冈本敏彦着)
现代畜殖(47～50)－郑绍营．六十三年三月第2卷第3期
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