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诊断鸡病时常用之血清学反应试验(二)
5.中和试验(Neutralization test)：
施行中和试验之目的有二：一为鉴定未知之病毒之种类，另一为定量鸡血清中含有之已知病毒抗体价。中和试验有於阶段稀释之血清系列中加入一定量之病毒之血清稀释法，及於阶段稀释之病毒系列中加入一定浓度之血清之病毒稀释法两种。对具有高抗体价之血清利用血清稀释法，而对抗体价低之血清即用病毒稀释法。中和试验之基本操作为病毒之定量，故拟先说明病毒之定量法。
(一)病毒感染量之测定法：
1.百分之五十感染量(Infective Dose 50；ID 50)
先将含有多量病毒之拟检材料做阶段稀释後各将其一定量接种於一定数目之试验动物，发育鸡蛋，或细胞培养试管中。检查其活性而以示50％活性之稀释度为感染价表示之方法也。判定病毒之活性方法常以发病，发病致死，抗体产生情形，细胞变性效果或红血球吸着反应等做为指标。
感染价之计算，一般常用贝、克两氏法Berench－Kerbel's method。其步骤如下：
(1)将拟检材料做十倍阶段稀释列系，选取可百分之百感染之稀释阶段至完全不感染之稀释阶段(通常有4～5稀释阶段)。
(2)将选取之各稀释阶段接种於一定数(4～5)之细胞培养试管中，发育鸡蛋中，或实验动物，然後观察一定时间，将感染个数如表六记录下来。
(3)百分之五十感染量(ID 50)之对数值D由下式求取：
D＝XK－(h1＋h2＋……＋hK－i)／n－0.5
XK乃百分之百感染之最高稀释之对数，h1＋h2＋……………＋hK－1乃表示百分之百感染率之稀释阶段之感染细胞培养试管数。n乃指各稀释阶段所接种之细胞培养试管数。
表六之结果可由XK＝－6，h1＝3，h2＝1，n＝4代入上式D＝－6－4／4－0.5＝7.5即其百分之五十感染量为10－75也亦即拟检材料之病毒感染价於0.1ml接种量时为107.5也。
(4)因使用於感染试验之宿主(组织培养试管，鸡胚，动物……及其他)及感染判定指标之不相同。百分之五十感染量有各种不同之记号。
2.坏死斑形成单位(Plague Formation Unif；PFU)或称Pock形成单位(Pock Formation Unit；PFU)：
一个病毒形成一个坏死斑，故将拟检材料行十倍阶段稀释後接种於2～4个细胞培养玻璃皿，或4～5个发育鸡蛋之浆尿膜上，使其形成孤立之坏死斑然後计算其数目。如拟检材料之10－6稀释液之0.1ml接种後得到平均30个坏死斑时拟检材料之1ml中有3×108或108.48PFU。
(二)稀释血清之中和试验：
如表八做成血清之四倍阶段稀释系列。混合稀释内容时不可使其形成泡沫。应於每稀释阶段用一支新吸管，又应注意到不可使血清附着於试管上部。血清之稀释液乃用病毒之稀释液，其配法请参照病毒分离方法中所述。
血清稀释完竣後，每试管加入以病毒稀释之病毒液各0.5ml加入之病毒量因病毒种类稍异，一般言常用每0.1ml中含有200TCID50；200LD50或50PFU之病毒量。即与稀释血清混合後之病毒量为0.1ml中含有100TCID50；100LD50或25PFU。
加入病毒液後将试管斜放缓慢上下移动而充分混合其内容液。然後置於37℃之水浴一小时或放置於冰箱中一夜使其作用(即中和作用)。然後将血清与病毒混合之一定量接种於试验动物，发育鸡蛋或组织培养试管中。此时最重要的是每一稀释管要使用个别的吸管或注射器不可混乱。血清之稀释时也然。
又每一试验均须设正常血清，标准血清及使用病毒之定量等之对照组。
其判定基准今以组织培养法中之试验法及坏死斑法加予说明如下：(待续)
表二 红 血 球 凝 集 抑 制 反 应 术 式 ( 血 清 稀 释 法 ) |
|||||||||||
| 试管号码 血清mI 盐水mI 抗原、(4单位)mI |
1(I＝5) 0.2 － 0.2 |
2(I＝5) 0.2→ 0.2 0.2 |
3 0.2→ 0.2 0.2 |
4 0.2→ 0.2 0.2 |
5 0.2→ 0.2 0.2 |
6 0.2→ 0.2 0.2 |
7 0.2→ 0.2 0.2 |
8 0.2→ 0.2 0.2 |
9 0.2→ 0.2 0.2 |
0.2 弃 去 |
10(I＝5) 0.2 0.2 － |
| 混合後於室温中静置10分钟 | |||||||||||
| 0.5％红血球 悬浮液mI |
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | |
| 判定 | 混合後於室温中静置45～60分钟 | ||||||||||
| 判定 血清稀释倍数 |
－ 5 |
－ 10 |
－ 20 |
－ 40 |
－ 80 |
－ 160 |
－ 320 |
± 640 |
＋ 1280 |
－ 5 |
|
表三 抗 原 对 照 |
|||||
| 试管号码 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 抗原单位 | 4 | 2 | 1 | 1/2 | 1/4 |
| 抗原mI | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 盐水mI | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 0.5％红血 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 球悬浮液 | 0.4 | 0.4 | |||
| 判定 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － |
表四 红 血 球 凝 集 抑 制 反 应 术 式 ( 抗 原 稀 释 法 ) |
|||||||||||
| 试管号码 抗原原液 mI(I＝10) 盐水mI 稀释血清mI |
1 0.2 － － 0.2 |
2 0.2→ 0.2
0.2 |
3 0.2→ 0.2
0.2 |
4 0.2→ 0.2
0.2 |
5 0.2→ 0.2
0.2 |
6 0.2→ 0.2
0.2 |
7 0.2→ 0.2
0.2 |
8 0.2→ 0.2
0.2 |
9 0.2→ 0.2
0.2 |
0.2 弃 去
|
10
0.2
0.2 |
| 混合後於室温中静置10分钟 | |||||||||||
| 0.5％红血球 悬浮液mI 抗原稀释倍数 |
0.4
10 |
0.4
20 |
0.4
40 |
0.4
80 |
0.4
160 |
0.4
320 |
0.4
640 |
0.4
1280 |
0.4
2560 |
0.4 | |
| 表五 | |||||||||||
抗原稀释倍数 |
10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | 640 | 128 | 2560 | 对 照 | |
使用之标准血清 |
正 常 血 清 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － |
| 新 城 病 | ＋ | ＋ | － | － | － | － | － | － | － | － | |
| 油凯巴病毒 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | |
| 鸡 瘟 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | |
现代畜殖(62～63)－沈永绍．六十三年三月第2卷第3期
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