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公猪冷冻精液
在瑞典斯德哥尔摩兽医学院(The Veterinary College of Stockholm)及美国明尼苏达大学(University of Minnesota)，以TES为主要缓冲液，做受胎试验择要如下。已发表的部分计有Crabo, B. G. Einarsson, S. Lamm, A. M., Soosalo, O.及Viring, S.冷冻公猪精液之受胎试验。在1972年慕尼黑举行之第七届国际家畜繁殖及人工授精会议上。Graham, E. F.及Crabo, B. G.宣布了一些影响冷冻公猪精液的因素。Ibid及Crabo B.及Graham, E. F.报告在试验室不同操作方法下做了对冷冻後公猪精液之评价以及其相互关系。Ibid, Crabo, B. G., Graham, E. F.及Larson, E. V.则在冷冻生物学会(Society of Cryobiology)第九届年会上宣布，解冻对公猪精液之影响。(报告将在1972年冷冻生物学(Cryobiology)上发表)。
程 序
所用之"缓冲剂"如附件一所示，当用氢氧化钾及氢氧化钠滴定後，我们称之TES Nak。在这些试验中，葡萄糖所用之总量可能可以增加10％。此外，另一可能为纯以葡萄糖溶液加蛋黄亦可使用。在早期明尼苏达的试验里，曾以TES为基础，以Tris代替氢氧化钾以氢气化钠。这种缓冲液称之为TEST。
冷冻程序在附件二中略述。静置精液的目的，在新采精液没有稀释可以在室温下静置1～1.5小时，於此期间精 自精浆中得到蛋白质作为被膜。此後，曾很注意的分为两步实施稀释。於最後甘油为2.5％浓度所做之妊娠试验结果在附件五中可以见到。在附件三发现1％的甘油所得之结果较为乐观，而且在最近的试验中应用。
为冷冻精液过程中最重要的一环，曾运用2种不同的解冻技术；液体解冻法及热铝板(55℃)解冻法；液体解冻法(如附件四)，在32～38℃间定温实施，其外以热水水浴器保持温度，此时以升高或放低液体容器调节容器内之温度，同时用匙每次取少量的冷冻精液加入容器中。在热板上解冻：在经Tetflon处理，定温控制的锅热到55℃时，将以50ml冷冻之粒状精液全部倒在热锅上，当粒状精液开始熔解时即刻切断电源。
授 精
曾以部份母猪在离乳後用PMS，HCG行同期化发情後，行授精试验。然大部均份系自然发情，授精工作在家畜发情之後期行之，如果第二天仍有发情现象则再行授精一次。在我们小规模的试验中，无法发现单次授精或复次授精间对受胎率的差异。在最初的试验(附件五及六)及以7.5×109精 数用以授精，在最近的试验(附件七)用的是6×109精 数量在24c.c.中冷冻，以50c.c.解冻的解冻液解冻(与附件三比较之)。
受 胎
精液以精浆解冻者(附件五)授精所得结果比在热板上解冻者之受胎要好的多(平均74％)。精液在TES NaK缓冲液解冻者无受胎力。起初我们想精浆可增加精 自子宫到输卵管的运动能力(参考Crabo, B. G., Einarsson, S., Acta Vet. Scand Morch. 1971)，Bower及Crabo在明尼苏达尚未发表的观察结果发现，精浆或精浆的分离液并不能增加子宫的收缩，Einarsson及Uiring在斯德哥尔摩以TES NaK缓冲液及精浆作解冻授精後，即刻比较输卵管中之精 较发现两者间并无差异。
进一步的阐明精浆效果之试验列於附件七，由其间可见出在已解冻的精液中加精浆并不能增加受胎，但在热锅上解冻者受胎率非常低，同时在TES NaK中解冻者没有受胎，在试验中所得结果最佳者为在精浆中解冻者。
有些结果可以说明，至少也有部份解冻率可以加以说明。我们知道当细胞没有在甘油或低浓度甘油的情形下冷冻，一定要急速解冻以防止发生冰的结晶。不论在热锅上或液体中解冻，二者均需具足够快的解冻率。总之，在时间上，即使有极少的冰，当在热锅上解冻时亦消失了，所以已解冻之液体温度急速下降(如附件八)，这一点可以用简单的物理学理由来解释，无论如何，可以知道其可以导致精 头帽受损。(参考Pursel, V. G., Johnson, L. A.及Rampacek, G. B.公猪精液在冷冻激震前保温之头帽形态学，J. Amin. Sci. 1972; 34, 278)。
在TES NaK缓冲液中解冻後失去受胎能力，可以精 头帽之形态学来解释；几乎在此处理之後的精 头帽都变形了，(附件九)，这种现象的背景并不完全了解，我们想，无论如何，当以精浆解冻时，精 所包被的精浆蛋白及解冻液的精浆蛋白行均冲的交换。TES NaK缓冲液有少量的离子，其将引起某种蛋白质沉淀。包被的蛋白质被认为是在没有甘油的情形下，为冷冻及解冻低温时保护所必须。
未来的发展
虽然在此所实行的技术，比其他讲到的技术所得到的受胎率要高些，然其仍未达到实际应用的理想，在没有增加使用输精管切除术公猪，则很难得到足够量的精浆以供解冻之用，而且TES缓冲液目前又是非常的昂贵。使用精浆以外的解冻液似乎已有可能。Pursel及Johnson曾以酪蛋白做为冷冻时惟一的蛋白源而得到受孕。而且我们亦以脱脂乳解冻而使之受孕。如上所述，牛乳及牛乳和精浆混合液将为进一步试验的解冻液。同时其他加蛋白质的等量食盐水亦将试验。
Polge及其同学们在英国使用纯葡萄糖加鸡蛋黄供作冷冻，我们自己观察最近得知，以不同比例的葡萄糖及TES NaK稀释，其间精 头帽之正常率差异甚微，是故亦可以纯葡萄糖稀释。
授精所需最少之精 数亦测定过了。
研究精液品质的方法，现在已很明确的指出。据我们的经验，决定精 活力不大有用，我们配以仅5％活力的精液得到很好的受胎，以很高的活力者反而没有受胎。在目前以位相差(Phase Contrast)显微镜计算精 头帽，似乎是最便宜赤最可靠的技术。有一件事需要研究，探讨是否精 具正常头帽者所占之百分率高，其受胎率亦高？在我们的经验，我们可以在不加任何蛋白质的柠檬酸溶液中解冻，而得到具有正常头帽的精 非常多，然而此种精液却有很低的受胎率。(配八头女猪，只有一头受孕)。
建议冷冻公猪精液之程序
1.用二个瓶子分别收集含精 较多的精液及含精 较少的精液部分、测定精 浓度，如果每c.c.精 数超过四亿时，则以含精 较少的精液部分来调整为每c.c.10亿精 。
2.把含精 较多的精液部分，在室温下放置1～15小时。(静置时间)。
3.以照附件一所述配制之TES NaK蛋黄(或53％葡萄糖──蛋黄)缓冲液，黑1：1之比稀释精液。
4.用双层的容器，亦可用一个玻璃或塑胶烧杯放在另外一个容器中，加约一公升室温的水，使精液约在3～3.5小时期间使温度冷到9～12℃。
5.再以加了2～3％甘油的缓冲液照1：1比例稀释一次，结果此时甘油浓度为1～1.5％。
6.以约0.07c.c.之量在乾冰上冷冻为一粒状。
7.在乾冰上大约经5分钟的冷冻，即将粒状精液置入液氮中。
8.分配每次授精之量；量的多寡，决定於期望之精 数，精 含量及精 品质。粒状精液之量为解冻後液态量的二倍。〔例：如果希望授精量中有60亿精 。在制造之初，原精液中每c.c.含精 10亿，则需量48c.c.的粒状精液，(因在最後稀释後每c.c.含精 250,000,000，因之60亿需24c.c.而粒状精液为48c.c.)〕。
9.照附件四所述方法解冻，解冻後尽可能的尽速行授精。
品质检查
对冷冻公猪精液而言，活力并非可靠的检查方法，至今在位相差显微镜下计算精 头帽，似乎为最可靠的方法。
准备湿样品的技术
一粒粒状精液在1c.c. 37℃的精浆中解冻。精浆需照如下方式处理。为防止蛋白质大量沉淀，以致在显徵镜下无法使用，以一份蛋黄及45份的精浆混合摇动，并分离，直至透明。如果是立即计算精 头帽，1滴等渗之氟化钠液以抑制精 活力。一滴精液及一滴6％甲醛在等渗食盐溶液中可以维持精 头帽之正常的一天，注意，在已解冻的精液中添加任何东西均须与其温度一样，以免发生冷的震颤，用一滴混合液滴在玻片上，加盖玻片，再用油镜检查。当镜检时只计算其头帽平展开者，计算到300～400个头帽时即可得到非常正确的百分率，此时正常的头帽百分率最高者即可能当作最好的加以使用。
附件一：稀释剂
TES-NaK
N. Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane sulfonic acid (TES) 0.325 Osm以2份0.325 M的NaOH及1份0.325M的KOH混合液调整到pH7.2。
添加0.325M (Osm)葡萄糖10 Vol ％。
添加新鲜蛋黄20～25 Vol ％。
添加抗生素。
附件二：冷冻程序
1.收集精 多的部份。
2.使其冷达室温(1～1.5小时)。
3.以TES-NaK缓冲液1：1稀释。
4.逐渐冷却至7～12℃(3～3.5小时)。
5.以含5％甘油之TES-NaK缓冲液再照1：1稀释。
6.即刻在乾冰上以丸粒状冻结。
7.将丸粒移入液氮中。
附件三：增强以TES-T或TES-NaK稀释之冷冻公猪品质之因素。
1.静置之时间(1～1.5小时)(精 包被)。
2.最後稀释後含25％的精浆。
3.最後稀释後含1％的甘油。
4.最後之精 浓度少於300. 106／ml。
附件四：液体解冻
液态氮→解冻→热水70℃。
现代畜殖(29～33)－戈定军译．六十三年五月第2卷第五期
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