公豬冷凍精液

        在瑞典斯德哥爾摩獸醫學院(The Veterinary College of Stockholm)及美國明尼蘇達大學(University of Minnesota)，以TES為主要緩衝液，做受胎試驗擇要如下。已發表的部分計有Crabo, B. G. Einarsson, S. Lamm, A. M., Soosalo, O.及Viring, S.冷凍公豬精液之受胎試驗。在1972年慕尼黑舉行之第七屆國際家畜繁殖及人工授精會議上。Graham, E. F.及Crabo, B. G.宣佈了一些影響冷凍公豬精液的因素。Ibid及Crabo B.及Graham, E. F.報告在試驗室不同操作方法下做了對冷凍後公豬精液之評價以及其相互關係。Ibid, Crabo, B. G., Graham, E. F.及Larson, E. V.則在冷凍生物學會(Society of Cryobiology)第九屆年會上宣佈，解凍對公豬精液之影響。(報告將在1972年冷凍生物學(Cryobiology)上發表)。

程   序

        所用之"緩衝劑"如附件一所示，當用氫氧化鉀及氫氧化鈉滴定後，我們稱之TES Nak。在這些試驗中，葡萄糖所用之總量可能可以增加10％。此外，另一可能為純以葡萄糖溶液加蛋黃亦可使用。

        在早期明尼蘇達的試驗裡，曾以TES為基礎，以Tris代替氫氧化鉀以氫氣化鈉。這種緩衝液稱之為TEST。

        冷凍程序在附件二中略述。靜置精液的目的，在新採精液沒有稀釋可以在室溫下靜置1∼1.5小時，於此期間精蟲自精漿中得到蛋白質作為被膜。此後，曾很注意的分為兩步實施稀釋。於最後甘油為2.5％濃度所做之妊娠試驗結果在附件五中可以見到。在附件三發現1％的甘油所得之結果較為樂觀，而且在最近的試驗中應用。

        為冷凍精液過程中最重要的一環，曾運用2種不同的解凍技術；液體解凍法及熱鋁板(55℃)解凍法；液體解凍法(如附件四)，在32∼38℃間定溫實施，其外以熱水水浴器保持溫度，此時以升高或放低液體容器調節容器內之溫度，同時用匙每次取少量的冷凍精液加入容器中。在熱板上解凍：在經Tetflon處理，定溫控制的鍋熱到55℃時，將以50ml冷凍之粒狀精液全部倒在熱鍋上，當粒狀精液開始熔解時即刻切斷電源。

授   精

        曾以部份母豬在離乳後用PMS，HCG行同期化發情後，行授精試驗。然大部均份係自然發情，授精工作在家畜發情之後期行之，如果第二天仍有發情現象則再行授精一次。在我們小規模的試驗中，無法發現單次授精或複次授精間對受胎率的差異。在最初的試驗(附件五及六)及以7.5×10⁹精蟲數用以授精，在最近的試驗(附件七)用的是6×10⁹精蟲數量在24c.c.中冷凍，以50c.c.解凍的解凍液解凍(與附件三比較之)。

受   胎  

        精液以精漿解凍者(附件五)授精所得結果比在熱板上解凍者之受胎要好的多(平均74％)。精液在TES NaK緩衝液解凍者無受胎力。起初我們想精漿可增加精蟲自子宮到輸卵管的運動能力(參考Crabo, B. G., Einarsson, S., Acta Vet. Scand Morch. 1971)，Bower及Crabo在明尼蘇達尚未發表的觀察結果發現，精漿或精漿的分離液並不能增加子宮的收縮，Einarsson及Uiring在斯德哥爾摩以TES NaK緩衝液及精漿作解凍授精後，即刻比較輸卵管中之精蟲較發現兩者間並無差異。

        進一步的闡明精漿效果之試驗列於附件七，由其間可見出在已解凍的精液中加精漿並不能增加受胎，但在熱鍋上解凍者受胎率非常低，同時在TES NaK中解凍者沒有受胎，在試驗中所得結果最佳者為在精漿中解凍者。

        有些結果可以說明，至少也有部份解凍率可以加以說明。我們知道當細胞沒有在甘油或低濃度甘油的情形下冷凍，一定要急速解凍以防止發生冰的結晶。不論在熱鍋上或液體中解凍，二者均需具足夠快的解凍率。總之，在時間上，即使有極少的冰，當在熱鍋上解凍時亦消失了，所以已解凍之液體溫度急速下降(如附件八)，這一點可以用簡單的物理學理由來解釋，無論如何，可以知道其可以導致精蟲頭帽受損。(參考Pursel, V. G., Johnson, L. A.及Rampacek, G. B.公豬精液在冷凍激震前保溫之頭帽形態學，J. Amin. Sci. 1972; 34, 278)。

        在TES NaK緩衝液中解凍後失去受胎能力，可以精蟲頭帽之形態學來解釋；幾乎在此處理之後的精蟲頭帽都變形了，(附件九)，這種現象的背景並不完全了解，我們想，無論如何，當以精漿解凍時，精蟲所包被的精漿蛋白及解凍液的精漿蛋白行均衝的交換。TES NaK緩衝液有少量的離子，其將引起某種蛋白質沉澱。包被的蛋白質被認為是在沒有甘油的情形下，為冷凍及解凍低溫時保護所必須。

未來的發展

        雖然在此所實行的技術，比其他講到的技術所得到的受胎率要高些，然其仍未達到實際應用的理想，在沒有增加使用輸精管切除術公豬，則很難得到足夠量的精漿以供解凍之用，而且TES緩衝液目前又是非常的昂貴。使用精漿以外的解凍液似乎已有可能。Pursel及Johnson曾以酪蛋白做為冷凍時惟一的蛋白源而得到受孕。而且我們亦以脫脂乳解凍而使之受孕。如上所述，牛乳及牛乳和精漿混合液將為進一步試驗的解凍液。同時其他加蛋白質的等量食鹽水亦將試驗。

        Polge及其同學們在英國使用純葡萄糖加雞蛋黃供作冷凍，我們自己觀察最近得知，以不同比例的葡萄糖及TES NaK稀釋，其間精蟲頭帽之正常率差異甚微，是故亦可以純葡萄糖稀釋。

        授精所需最少之精蟲數亦測定過了。

        研究精液品質的方法，現在已很明確的指出。據我們的經驗，決定精蟲活力不大有用，我們配以僅5％活力的精液得到很好的受胎，以很高的活力者反而沒有受胎。在目前以位相差(Phase Contrast)顯微鏡計算精蟲頭帽，似乎是最便宜赤最可靠的技術。有一件事需要研究，探討是否精蟲具正常頭帽者所佔之百分率高，其受胎率亦高？在我們的經驗，我們可以在不加任何蛋白質的檸檬酸溶液中解凍，而得到具有正常頭帽的精蟲非常多，然而此種精液卻有很低的受胎率。(配八頭女豬，只有一頭受孕)。

建議冷凍公豬精液之程序

        1.用二個瓶子分別收集含精蟲較多的精液及含精蟲較少的精液部分、測定精蟲濃度，如果每c.c.精蟲數超過四億時，則以含精蟲較少的精液部分來調整為每c.c.10億精蟲。

        2.把含精蟲較多的精液部分，在室溫下放置1∼15小時。(靜置時間)。

        3.以照附件一所述配製之TES NaK蛋黃(或53％葡萄糖──蛋黃)緩衝液，黑1：1之比稀釋精液。

        4.用雙層的容器，亦可用一個玻璃或塑膠燒杯放在另外一個容器中，加約一公升室溫的水，使精液約在3∼3.5小時期間使溫度冷到9∼12℃。

        5.再以加了2∼3％甘油的緩衝液照1：1比例稀釋一次，結果此時甘油濃度為1∼1.5％。

        6.以約0.07c.c.之量在乾冰上冷凍為一粒狀。

        7.在乾冰上大約經5分鐘的冷凍，即將粒狀精液置入液氮中。

        8.分配每次授精之量；量的多寡，決定於期望之精蟲數，精蟲含量及精蟲品質。粒狀精液之量為解凍後液態量的二倍。〔例：如果希望授精量中有60億精蟲。在製造之初，原精液中每c.c.含精蟲10億，則需量48c.c.的粒狀精液，(因在最後稀釋後每c.c.含精蟲250,000,000，因之60億需24c.c.而粒狀精液為48c.c.)〕。

        9.照附件四所述方法解凍，解凍後儘可能的儘速行授精。

品質檢查

        對冷凍公豬精液而言，活力並非可靠的檢查方法，至今在位相差顯微鏡下計算精蟲頭帽，似乎為最可靠的方法。

準備濕樣品的技術

        一粒粒狀精液在1c.c. 37℃的精漿中解凍。精漿需照如下方式處理。為防止蛋白質大量沉澱，以致在顯徵鏡下無法使用，以一份蛋黃及45份的精漿混合搖動，並分離，直至透明。如果是立即計算精蟲頭帽，1滴等滲之氟化鈉液以抑制精蟲活力。一滴精液及一滴6％甲醛在等滲食鹽溶液中可以維持精蟲頭帽之正常的一天，注意，在已解凍的精液中添加任何東西均須與其溫度一樣，以免發生冷的震顫，用一滴混合液滴在玻片上，加蓋玻片，再用油鏡檢查。當鏡檢時只計算其頭帽平展開者，計算到300∼400個頭帽時即可得到非常正確的百分率，此時正常的頭帽百分率最高者即可能當作最好的加以使用。

附件一：稀釋劑

    TES-NaK

        N. Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane sulfonic acid (TES) 0.325 Osm以2份0.325 M的NaOH及1份0.325M的KOH混合液調整到pH7.2。    

        添加0.325M (Osm)葡萄糖10 Vol ％。

        添加新鮮蛋黃20∼25 Vol ％。

        添加抗生素。

附件二：冷凍程序

        1.收集精蟲多的部份。

        2.使其冷達室溫(1∼1.5小時)。

        3.以TES-NaK緩衝液1：1稀釋。

        4.逐漸冷卻至7∼12℃(3∼3.5小時)。

        5.以含5％甘油之TES-NaK緩衝液再照1：1稀釋。

        6.即刻在乾冰上以丸粒狀凍結。

        7.將丸粒移入液氮中。

附件三：增強以TES-T或TES-NaK稀釋之冷凍公豬品質之因素。

        1.靜置之時間(1∼1.5小時)(精蟲包被)。

        2.最後稀釋後含25％的精漿。

        3.最後稀釋後含1％的甘油。

        4.最後之精蟲濃度少於300. 10⁶／ml。

附件四：液體解凍

        液態氮→解凍→熱水70℃。

                                    現代畜殖(29∼33)－戈定軍譯．六十三年五月第2卷第五期

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