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中藥天然低分子物質研究法
(三)沈澱法
鉛鹽法係粗浸膏之水或木精溶液加酢酸鉛或鹽基性酢酸鉛之飽和溶液使其分為沈澱(有機酸類，䳭酸類，基他之苯酚性化合物，鹽基性物質，蛋白質等)及不沈澱者之分離方法。從前用於比較大規模植物成分之分離。脫鉛則使用硫化氫，但作成藥理試驗之檢體時應留意鉛離子及疏黃之混入，以離子交換樹脂行脫鉛操作較宜。
(四)以衍化體分離
收量容易而且易於回復原物質之衍化體，可將精製成分誘導予以分離，例如將脂肪酸及𠯿，碳酸以酯蒸餾，或者以分取瓦斯色光度器分離，或將生物鹼作成各種監類使其結晶，或者將具有酒精性或苯酚性基之成分以醋酸或Benzoate變化溶解度再結晶，或使用柱層析法最為平常。同時acyl衍化體中Azobeuzoate為有色物質，如將無色成分作成此型以column chromatograpby分離時較為方便。Ketone，乙醛aldehyde，之分離與carbonyl衍化體hydrozone由Girard試藥而分離之分離法有效地曾應用於類固醇激素之精製。
最後的精製法有再結晶法及蒸餾法，上述方法係以早期狹義地天然化學研究對象之中低分子成分之分離法，惟具有生理活性之物質未必為分子量小之成分，自有高分子之物質存在，故須用生化學的方法中透析或分子篩法，無論如何經濟的有效的分離並精製大量天然化合物之方法其未解決的問題仍多，而且有待今後之研究。
(五)分離精製過程中成分之分解
粗浸膏所具活性經分離結果在各分劃活性降低或各分劃的綜合活性不能出現時，涉及分離過程中有效成分分解之可能性者較多。應就各分劃以薄層層析法或濾紙層析法，瓦斯層析法與分解前試料行比較試驗。在酒精中長時間加熱時有酯及lactone類之alcoholysis，acetal，ketal分解及生成，以酸及鹼處理時加水分解、轉化racemic化等為周知之事實。純物質遲度反應時在粗fraction中由於夾雜物的觸媒發生作用而容易分解，亦為應留意者。相反的由於具有安定劑作用物質被去除，精製後則變成不安定。
最近Wenkert等證實由Rosmarinus spp.及Salvia spp.所分離之carnosol及rosmaricine(生物鹼)均為抽出中由carnosic acid生成之二次的生成物。前者於抽出分離中受空氣氧化，後者受空氣氧化與分離中使用之氨之作用而生成。
香菇之香氣亦為二次的生成物lenthionine所致，此係由前驅物質A所生，此事實由森田等證實，如此二次產物較為有用者有之，紫之有效成分亦屬比例。瀧澤證實紅茶係以茶葉自己酵素氧化製成，此係Catechin類引起氧化的縮合而形成有色染料。
五、構造的決定
確認精製化合物構造前最重要者為判斷此物質在植物化學成分的分類上屬於何系統。此點須考慮左列各項。
(一)分離精製過程
對溶媒之溶解度，酸性苯酚性，鹽基性之區別，揮發性及柱層析法之吸著性，以至薄層層析法之Rf值，瓦斯層析法時之保持時間等將提供重要提示已如前述。
(二)各種呈色反應
苯酚系化合物之FeCl3反應，diazo反應，生物鹼之Dragendorff反應，類固醇triterpenoid之Liebermann反應，flavonoid之Mg－HCl反應等，此外紫外線照射下之有無螢光性為判定芳香族化合物基本構造時頗有用。
(三)紫外及可視部之光譜
炭水化物，脂肪酸，以及無共軛不飽和系之類固醇，terpenoid等雖不呈「最大吸收」但具有共軛不飽和系者及芳香族化合物均呈特異的吸收曲線。由此多可推定其基本構造，但有時須將acetate之衍化物OH，＞NH等效果減少始能觀察分子構造本身之吸收。有關天然有機化合物全部之紫外，可視部光譜之參考書，Scott之著書頗具盛名。
(四)紅外部吸收光譜
3000∼2800Cm-1附近有強吸收者為脂肪族化合物，相反的此附近吸收相對的弱1600∼1500Cm-1附近及1100Cm-1以下有多數強吸收者芳香族化合物之可能較大。3600∼3300Cm-1附近及1100Cm-1附近有強幅吸收者為含有多數-OH之化合物，類似炭水化物，配糖體等之可能性較大。天然苯酚系化合物而具有每-OH行分子內氫結合之＞C＝O者－例如(對)苯𠎀類，flavonoid及其他－多在1650∼1610Cm-1附近呈強吸收。具氨基性結合的化合物(𡌅)亦在此附近呈吸收。
(五)核磁共振光譜
脂肪族化合物於T8∼9附近呈現複雜偶連(Coupling)信號(Signal)！尤其此附近出現之－C－CH3及H－C－CH3之信號數及連結之樣式有助於類固醇mono，sesgui及triterpenoid之區別。相反的芳香族化合物於此附近之偶連少(通常除CH3及－CO－CH3外概不能發現)，並於T2∼3附近呈現與芳香族proton對應之信號。核磁共振光譜以CHCl3，CCl4等溶液測定為宜，但具多數功能基之天然化合物難溶於此類溶劑，不得不用以重氫置換之Olimethyl sulfoxide Pyridive acetone。解析時應考慮溶媒效果為要。
(六)其他之物理化學的性狀
融點，有無旋光度，Pka;mass spectrum (Mass-speclade)。
(七)Chemotaxonomy的觀法：
植物成分中有含有糖類，sterol類，triterpenoid(α及β-amyrin.oleanolic acid,lupeol等)者。亦有如flavohoid廣汎含於多種科屬之植物及特異的出現於與形態分類具有密切關係之植物者最近考察此種學問之領域常用(hemotaxomomy術語)。屬於後者有如自古則為眾知之生物鹼，冠以植物科屬名呼之，茄科生物鹼，防已科生物鹼，荳科生物鹼石蒜科生物鹼鳥頭科生物鹼，黃楊科Buxaceal生物鹼，楝科meliaceal生物鹼，藜蘆veratrum生物鹼高卡生物鹼。其他系統之化合物薯蕷科之類固醇系皂素，蘿摩(Asclepiada ceae)科之pregnan系化合物，meliaceal科、芸香料，苦木科之苦味質(degradated triterpene)，五加科，人參屬三𠯿(Triterpene)配糖體、蕨類、三𠯿類松科、杉科，蘿漢松科等之二𠯿(Diterpene)類，菊科之sesqui terpene及乙炔系化合物，柏科之sesgui terpene，繖形花科之Coumariue、脂肪酸、Butylphthalate，豆科之Isoflavove，茜草科、蓼科之羥基葸𠎀(Oxyanthraquinone)，地衣類之芳香羥酸酯，地衣內脂等有多數例最近已經證實其存在。
由以上述理由先調查研究對象植物之近綠者，含有何種成分已被分離，做為確認構造之參攷，具有重要提示作用。
同時一種植物中多混有構造類似之數個成分 ，因此先知悉由該植物已分離出何種化合物亦有必要。
考察以上各點時，不只要注意其表面上之化學構造，亦要充分考慮植物中成分之生合成經路。例如鴉片中有多種生物鹼共存，其中有發現化學構造上屬於不同系統，但其生合成實有互相密切關連。
由上述預備試驗的考察，如能推定其化合物屬於何系統時，分別按其系統化合物之特有研究方法進一步實行詳細構造研究。
(八)分子式之決定
經原物質及其衍化物之元素分析，分子量測定結果決定分子式。分子量測定主以質量光譜，X線測定法或Osmometer測定法行之，此等方法比過去所用方法簡便而且正確。核磁共振光譜亦能相當正確地表示分子中H數，故決定分子式頗有用。
(九)與既知化合物之鑑定
所得化合物是否屬於文獻上既知之天然化合物，其文獻調查方法將作其他記述，雖未由天然物單離但以合成品或其他天然化合物之衍化體，分解產物出現者亦有可能性。此種情況之文獻調查甚困難，時須進行構造研究，同時調查有關其系統之化合物之總說及參考書。
物質之鑑別普通實行混融，但複雜的天然化合物之立體異性體間往往不呈顯著融點下降。而且多功能基之化合物亦有不呈明確融點者。現今併用紅外線光譜，薄層層析法，質普光譜(新近有瓦斯層析法，與質譜儀法直結裝置出售)或X線粉末法予以鑑別，不但應用於原物質之比較，衍化體間之鑑別時亦有必要。
光學的異性體間之鑑別不僅要求〔α〕p，最近常比較檢討施光散曲線。racemic體與光學活性體間，兩者溶液之紅外線光譜雖然一致，但固體之光譜不一致。
(十)未知成分之構造研究
對新物質行構造研究時可以分下列四種方法：
第一方法為檢討紅外光譜、紫外光譜、核磁共振光譜、質普光譜等物理化學的成績，各種衍化體之分析結果後決定功能性基種類、數量，進而由化學的變型將該物質與既知物質相互作用而決定構造，而接其系統化合物研究法之常軌決定置換基之位置及配位。光學的活性體(terpenoid steroid alkoloid等)其旋光分散曲線及丹二色性曲線之解析，對於推定C=O等之位置及其周邊之立體構造有益。
第二方法為該系統之天然物既有多數化合物被發現而對該物質或其衍化體關連之化學的或物理化學的成績整理，法則性已確立者，由於所得試料少量時，將該物質以符合前述法則而推定其構造。例如gibberellin群自A1開始有多數化合物被發現。此類物質之核磁共振光譜，質普光譜之一般的法則已確立，極微量之具有gibbane構造之新物質被發現時亦可決定其構造。此類化合物因對其植物生長之活性有助於推定具有gibbane構造。以特有生理活性作為未知物質基本構造之推定之重要關鍵有之。
第三方法為物質量少而由前述方法及合成的考察或chemotaxonomy的推察略能推定其構造時，不必將原物質再行化學的變型或分解，由既知物質半合成的衍化而決定其構造。此法需要高度有機化學的知識不待贅言。
Helmintl osporum Sativum中之Sativene的構造，可能為同菌之代謝產物helminthosporin之生合成中間體，而且由紅外光譜，核磁共振光譜推定時上列式最為妥當，Corey等由生合成的有關連之longifolene以巧妙的transanular之Hydride shift反應實施對掌體之半合成，進而決定立體構造。
第四方法為X線解析法。最近電子計算機進步，若能得到適當結晶，短期間內即可確定其構造。具有新構造之化合物，依照過去方法不易研究其構造時，現今則常以X線解析法研究，能節省試料、時間，而且亦不必行分解反應。解析時須要製造halogen及重金屬衍化體之單結晶，因此須先檢討原物質之功能基性狀。同時亦須明瞭用於解析之衍化體與原物質間化學的關係，上述各點之試驗，現今以各種光譜物理化學的方法發揮高度力量而能達此目的。(譯自「醫藥品研究法」田中治、岡本敏彥著)
現代畜殖(47∼50)－鄭紹營．六十三年三月第2卷第3期
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