診斷雞病時常用之血清學反應試驗(二)

5.中和試驗(Neutralization test)：

        施行中和試驗之目的有二：一為鑑定未知之病毒之種類，另一為定量雞血清中含有之已知病毒抗體價。中和試驗有於階段稀釋之血清系列中加入一定量之病毒之血清稀釋法，及於階段稀釋之病毒系列中加入一定濃度之血清之病毒稀釋法兩種。對具有高抗體價之血清利用血清稀釋法，而對抗體價低之血清即用病毒稀釋法。

        中和試驗之基本操作為病毒之定量，故擬先說明病毒之定量法。

(一)病毒感染量之測定法：

1.百分之五十感染量(Infective Dose 50；ID 50)

        先將含有多量病毒之擬檢材料做階段稀釋後各將其一定量接種於一定數目之試驗動物，發育雞蛋，或細胞培養試管中。檢查其活性而以示50％活性之稀釋度為感染價表示之方法也。判定病毒之活性方法常以發病，發病致死，抗體產生情形，細胞變性效果或紅血球吸著反應等做為指標。

        感染價之計算，一般常用貝、克兩氏法Berench－Kerbel's method。其步驟如下：

        (1)將擬檢材料做十倍階段稀釋列系，選取可百分之百感染之稀釋階段至完全不感染之稀釋階段(通常有4∼5稀釋階段)。

        (2)將選取之各稀釋階段接種於一定數(4∼5)之細胞培養試管中，發育雞蛋中，或實驗動物，然後觀察一定時間，將感染個數如表六記錄下來。

        (3)百分之五十感染量(ID 50)之對數值D由下式求取：

             D＝XK－(h1＋h2＋……＋hK－i)／n－0.5

        XK乃百分之百感染之最高稀釋之對數，h1＋h2＋……………＋hK－1乃表示百分之百感染率之稀釋階段之感染細胞培養試管數。n乃指各稀釋階段所接種之細胞培養試管數。

        表六之結果可由XK＝－6，h1＝3，h2＝1，n＝4代入上式D＝－6－4／4－0.5＝7.5即其百分之五十感染量為10－75也亦即擬檢材料之病毒感染價於0.1ml接種量時為107.5也。

        (4)因使用於感染試驗之宿主(組織培養試管，雞胚，動物……及其他)及感染判定指標之不相同。百分之五十感染量有各種不同之記號。

2.壞死斑形成單位(Plague Formation Unif；PFU)或稱Pock形成單位(Pock Formation Unit；PFU)：

        一個病毒形成一個壞死斑，故將擬檢材料行十倍階段稀釋後接種於2∼4個細胞培養玻璃皿，或4∼5個發育雞蛋之漿尿膜上，使其形成孤立之壞死斑然後計算其數目。

        如擬檢材料之10－6稀釋液之0.1ml接種後得到平均30個壞死斑時擬檢材料之1ml中有3×108或108.48PFU。

(二)稀釋血清之中和試驗：

        如表八做成血清之四倍階段稀釋系列。混合稀釋內容時不可使其形成泡沫。應於每稀釋階段用一支新吸管，又應注意到不可使血清附著於試管上部。血清之稀釋液乃用病毒之稀釋液，其配法請參照病毒分離方法中所述。

        血清稀釋完竣後，每試管加入以病毒稀釋之病毒液各0.5ml加入之病毒量因病毒種類稍異，一般言常用每0.1ml中含有200TCID50；200LD50或50PFU之病毒量。即與稀釋血清混合後之病毒量為0.1ml中含有100TCID50；100LD50或25PFU。

        加入病毒液後將試管斜放緩慢上下移動而充分混合其內容液。然後置於37℃之水浴一小時或放置於冰箱中一夜使其作用(即中和作用)。然後將血清與病毒混合之一定量接種於試驗動物，發育雞蛋或組織培養試管中。此時最重要的是每一稀釋管要使用個別的吸管或注射器不可混亂。血清之稀釋時也然。

        又每一試驗均須設正常血清，標準血清及使用病毒之定量等之對照組。

        其判定基準今以組織培養法中之試驗法及壞死斑法加予說明如下：(待續)

表二     紅      血      球       凝      集       抑      制       反      應       術      式  (  血   清  稀  釋  法  )
試管號碼

血清mI

鹽水mI

抗原、(4單位)mI

 1(I＝5)

0.2

－

0.2

 2(I＝5)

0.2→

0.2↗

0.2

 3

0.2→

0.2↗

0.2

 4

0.2→

0.2↗

0.2

 5

0.2→

0.2↗

0.2

 6

0.2→

0.2↗

0.2

 7

0.2→

0.2↗

0.2

 8

0.2→

0.2↗

0.2

 9

0.2→

0.2↗

0.2

 　

0.2

棄

去

 10(I＝5)

0.2

0.2

－
　 混合後於室溫中靜置10分鐘
0.5％紅血球

懸浮液mI

 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 　 0.4
判定 混合後於室溫中靜置45∼60分鐘
判定

血清稀釋倍數

 －

5

 －

10

 －

20

 －

40

 －

80

 －

160

 －

320

 ±

640

 ＋

1280

 　 －

5

　

表三    抗               原               對               照
試管號碼 1 2 3 4 5
抗原單位 4 2 1 1/2 1/4
抗原mI 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
鹽水mI 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
0.5％紅血 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
球懸浮液 0.4 0.4 　 　 　
判定 ＋ ＋ ＋ ＋ －

　

表四     紅      血      球       凝      集       抑      制       反      應       術      式  (  抗   原  稀  釋  法  )
試管號碼

抗原原液

mI(I＝10)

鹽水mI

稀釋血清mI

 1

0.2

－

－

0.2

 2

0.2→

0.2↗

　

0.2

 3

0.2→

0.2↗

　

0.2

 4

0.2→

0.2↗

　

0.2

 5

0.2→

0.2↗

　

0.2

 6

0.2→

0.2↗

　

0.2

 7

0.2→

0.2↗

　

0.2

 8

0.2→

0.2↗

　

0.2

 9

0.2→

0.2↗

　

0.2

 　

0.2

棄

去

　

 10

　

0.2

　

0.2
　 混合後於室溫中靜置10分鐘
0.5％紅血球

懸浮液mI

抗原稀釋倍數

 0.4

　

10

 0.4

　

20

 0.4

　

40

 0.4

　

80

 0.4

　

160

 0.4

　

320

 0.4

　

640

 0.4

　

1280

 0.4

　

2560

 　 0.4

　

表五

抗原稀釋倍數

 10 20 40 80 160 320 640 128 2560 對 照

使用之標準血清

 正 常  血 清 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
新    城    病 ＋ ＋ － － － － － － － －
油凱巴病毒 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
雞             瘟 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －

                                         現代畜殖(62∼63)－沈永紹．六十三年三月第2卷第3期

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